تست :
آزمايش احياي رنگ نيتروبلو تترا زوليوم (Test Reduction-NBT ) به روش تحريكي
(موسوم به آزمايش NBT)
کاربرد تست :
بررسي عملكرد فاگوسيت ها از نظر انفجار تنفسي .
كاربرد اين تست در بررسي توانايي يا كفايت مرحله نهايي عمل فاگوسيتوز است.
مقدمه:
گلبولهاي سفيد خون تشكيل شده:
از نوتروفيل ها ( حدودا 60درصد)
لنفوسيت ها ( حدودا 35درصد)
مونوسيت ها( تقريبا 4درصد)
بازوفيل ها و ائوزینوفیل ها( حدود 1 )
(كه بازوفيلها را با رنگ آميزي هاي هماتولوژي معمولي مثل گيمسا نميبينيم مگر اينكه با رايت رنگ آميزی کنند)
از بين اين سلولها، نوتروفيلها در برخورد با پاتوژن هاي معمولي مهم تر ميباشند زيرا كه اولاً آنها در واكنشهاي فاز حاد التهابي زودتر از
بقيه سلولها وارد عمل ميشوندو ثانيا تعدادشان در نمونه خون بيشتر از ساير لكوسيت ها است و ثالثا در هنگام نياز، سريعتر از بقيه در مغز استخوان توليد مي شوند وتعدادشان به فوريت بالا ميرود.
اساس تست:
تبديل (NBT محلول و زرد) به فورمازان (نامحلول و آبي) در جريان انفجارتنفسي فاگوسيت هاي سالم.
اساس تست هنوزبخوبي مشخص نيست ولي از آنجائيكه يكسري واكنشهاي قوي اكسيداسيون و احيا در داخل نوتروفيل ها به دنبال بلع
مواد بيگانه رخ ميدهد، بنظرميرسد درجريان انفجار تنفسي و اكسيداسيون برخي مواد، NBT نيز كه به رنگ زرد كمرنگ است در درون فاگولیزوزوم احیا شده و به ماده آبي پررنگ و نامحلول فورمازان مبدل ميشود كه درداخل فاگوسيت ها (عمدتا نوتروفيلها) به صورت
لكه هاي رنگي(رسوب سرمهاي) نمايان مي شود. فاگوسيت هاي معيوب قادر به ايجاد رسوب رنگي نيستند.
طريقه انجام:
1 .برداشت 100ميكرو ليتر نمونه خون بيمار(همراه با ضد انعقاد EDTA شبيه خونگيري معمولي براي CBC ) درون لوله ميريزيم.
2. افزودن 100 میکرولیتر محلول N.B.T
3 .افزودن 100ميكرو ليتر محلول P.M.A به عنوان محرك كه نوتروفيل ها را وادار به فعاليت
بيشتر مي كند و البته به سرعت انجام آزمايش نيز كمك ميكند و جواب هاي دقيق تري به دست مي دهد. در برخي روشها مقدار
معيني لاتكس يا LPS بعنوان محرك به محلول رنگي NBT مي افزايند.
4 .انكوباسيون لوله در 37 درجه سانتيگراد (ترجيحاً) يا دماي اتاق به مدت 20 دقيقه.
5 .تهيه اسمير از نمونه، فيكساسيون و رنگ آميزي با رنگ گيمسا يا رايت (يا هريك از رنگهاي رومانوفسكي)
6 .بررسي لام زير ميكروسكوپ (يالام نئوبار)
نكته1 : براي افزايش لكوسيت هاي نمونه،سانتريفيوژ ملايم با دور كم انجام ميدهيم.در سرعت كم بافي كوت تشكيل نميشود و بايد از
قسمت فوقاني هماتوكريت لام تهيه ميكنيم.
نكته2 : رنگ گيمسا با آب همراه است در نتيجه RBC و WBC را دژنره ميكند پس به فيكس نياز دارد. فيكس كردن به دو روش
انجام ميشود:1) اتانول ،2) حرارت.
در اين تست ما به سلول زنده نياز داريم و به دليل اينكه حرارت سلول را ميكشد در نتيجه از اتانول برای فیکس کردن استفاده می کنیم.
نكته3 : براي اينكه رسوب رنگ در لام تشكيل نشود بايد از رنگ تازه استفاده شود و يا رنگ رسوب دار را از كاغذ صافي بگذرانيم.
تفسیر نتایج:
باید توجه داشت که شدت بیماری بستگی به نوع موتاسيون و شدت نقص ژنتيكي دارد.
اگر انديس محاسبه بيش از 95 % شمارش داشتيم اين فرد سالم است.
اگر انديس محاسبه از 85 %تا 95%باشد، فرد مشكوك است. بهتر است تكرار شود يا آزمايش روي نمونه مادر هم (بعنوان كرير احتمالي) انجام
گيرد.
اگر انديس محاسبه بين 10%تا 85%باشد معمولا فرد ناقل است. مادران كودكان مبتلا نيز چنين وضعي دارند مشروط به آنكه بيماري از نوع
ژنتيكي و آن هم وابسته به X باشد. اگر انديس محاسبه كمتر از 10 %باشد فرد بيمار است.
اهميت باليني:
اهميت توليد واسطه هاي فعال اكسيژن در نوتروفيلها، در بيماري گرانولوماتوز مزمن (Disease Granulomatous Chronic) مشخص
ميشود. در اين بيماري كه اولين بار در سال 1975 معرفي شد در هنگام ايجاد عفونت، نوتروفيل ها از رگ خارج ميشوند و ميكروبها را
مي بلعند اما نميتوانند بطور كامل آنها را از بين ببرند. لذا بعد از مدتي سلول ميميرد اما ميكروب درون آن زنده است و همين موجب
شيميوتاكسي بيشتر و بيشتر لكوسيت ها به منطقه است بطوريكه با گذشت زمان، حضور منوسيت ها و لنفوسيتهاي B وT هم به منطقه
پديدار ميشود و آبسه هاي چركي و كانونهاي عفوني به سختي بهبود مي يابند و چنانچه محل ضايعه را (اعم از بيوپسي پوست يا طحال يا
بيوپسي عقده هاي لنفاوي متورم موسوم به لنفادنوپاتي را) زير ميكروسكوپ ببينيم مثل مناطق دايره آبي پررنگ (رنگ هماتوكسيلين به شدت توسط هسته لوکوسیت ها جذب می شود) مشاهده ميشود كه همان كانون هاي متعددگرانولومي هستند. شخص بيمار تنها متكي به دفنسين ها و آنزيمهاي پروتئوليتيك درون ليزوزم هاست و به علت عدم توانايي نوتروفيلها در توليد واسطه هاي فعال اكسيژن، مبتلا به انواع عفونت هاي باكتريايي و قارچي راجعه ميشود. بيماري CGD در حدود دو سوم موارد (70درصد) الگوي توارثي وابسته به X مغلوب و در يك سوم
باقيمانده (حدود 30 %) الگوي اتوزومال مغلوب دارد. بيماري معمولاً در اوايل كودكي و به دليل وجود عفونتهاي باكتريايي درون سلولي و
قارچي راجعه تشخيص داده ميشود. از آنجا كه در اين بيماري فاگوسيت ها قادر به كنترل عفونت نميباشند، لذا تحريك مزمن پاسخ هاي ايمني سلولي و در نتيجه، فعال شدن مداوم ماكروفاژها، منجر به ايجاد گرانولوما ميشود. ژن معيوب را ميتوان با روشهاي مولكولي (PCR) تشخيص داد كه عمدتا مربوط به ژنهاي PHOX ميباشد. در 50 %موارد، ژن اين آنزيم بر روي كروموزوم 16 و7 و 1 يافت ميشوند.
PHOX نام مخفف آنزيم فاگوسيت اكسيداز يا NADPH اكسيداز است كه به صورت كمپلكس آنزيمي است و مهمترين عملكرد آن احياي
اكسيژن مولكولي و تبديل آن به واسطه فعال اكسيژن نظير راديكالهاي سوپراكسيد است. اين مجموعه آنزيم در غشاي اندامكهاي
فاگوليزوزومي واقع است.
البته اكثر بيماران مبتلا به CGD به علت وجود اين نقص در فاگوسيت ها با آنتي بيوتيك زنده ميمانند؛ ولي نه دائما زيرا مصرف مداوم آنتي بيوتيك باعث ايجاد مقاومت ميشود در نتيجه يك تا دو هفته مصرف را قطع ميكنند و سپس دوباره شروع ميكنند. اگر در حين قطع دارو عفونتي پيدا شد يا تست ESR انجام دادند و التهاب وجود داشت و يا علائمي داشتند دارو را زودتر شروع ميكنند كه ممكن است كوتريموكسازول يا داروي آنتي بيوتيك قويتري باشد (كوتريموكسازول آنتي بيوتيك زمينه است يعني براي پروفيلاكسي استفاده ميشود.)
اما اين بيماران مبتلا به CGD صورتهاي پر جوش و پوست داراي جوشگاه هاي متعدد دارند. اين بيماران به ويژه در مقابل باكتري هاي كاتالاز مثبت ناتوانند زيرا:
1 .اين نوع باكتريها توسط آنزيم كاتالاز خود، مقادير اندك آب اكسيژنه موجود را هم تجزيه ميكنند و در برابر سلولهاي فاگوسيت مقاومت ميكنند. در حاليكه عفونت با ميكروبهاي كاتالاز منفي در بيماران CGD بهتر كنترل ميشود.
2 .باكتريها در شرايط in vivo در جريان متابوليسم خودشان در هنگام تكثير در بافت و محيط بسته H2O2 توليد كرده و ميميرند ولي كاتالاز مثبتها به دليل داشتن اين آنزيم متابوليتهاي سمي خود را از بين ميبرند و در نتيجه پايداري بيشتري دارند.
ميكروبهايي كه عموماً از نمونه افراد CGDجدا ميشود عبارتنداز:
الف) باكتري هاي گرم مثبت (استافيلوكوك ها: S. aureus و S.epidermitis)
ب) باكتري هاي گرم منفي (Seratia marscesense و Burkholderia)
ج) قارچ (آسپرژيلوس فوميكاتوس و كانديدا (توانايي تجزيه H2O2 را دارد.)
علاوه بر پوست و طحال و كبد، ريه اين بيماران نيز به سرعت عفوني ميشود. معمولاً در ريه اين بيماران يك توپ قارچي درست ميشود و با
سيتي اسكن قابل تشخيص است(فونگوس بال). ريه بيماران CGD پر از كانونهاي عفوني خصوصا بعضي قارچهاست.
نكته1 ) در بيماران CGD آبسه در وهله اول در ريه و سپس در دستگاه گوارش و پوست به وجود مي آيد. حتي ممكن است گرانولوما سبب
انسداد روده شود؛ اما ضايعات پوستي زودتر در معرض چشم والدين و پزشك قرار ميگيرد و جلب توجه مي کند.
نكته2 ) بيماران CGD معمولاً G6PD شان هم مختل است.
در توليد مواد ضد ميكروبي مسير وابسته به اكسيژن معمولا يونهاي هاليدي كه در راس آنها كلر است مورد استفاده قرار ميگيرد و محصولي
مثلHCLO كه حكم وايتكس را دارد توليد ميشود.
راديكال هاي آزاد ميتوانند پروتئين را دناتوره كرده و آنزيم هاي باكتري را مختل كنند.