رنگ آمیزی گیمسا

بدن ما از انواع مختلف سلول های خونی تشکیل شده است. این سلول ها که دارای اشکال و اندازه های مختلفی هستند، طبق ساختار خود رنگ آمیزی می شوند. بنابراین سلول ها را به 3 دسته خنثی، اسیدوفیل و بازوفیل تقسیم می کنند.

• اجزا و ساختمانهای اسیدی سلولها رنگهای قلیائی را می پذیرند لذا این ساختمانها را بازوفیلیک(قلیا دوست) دوستار مواد بازی گویند,مثل هسته سلول که در این رنگ آمیزی آبی رنگ میشود.

• اجزا وساختمانهائی که فقط رنگینه های اسیدی را بخود راه میدهند اسیدوفیلیک (اسید دوست)یا ائوزینوفیلیک(ائوزین دوست) می نامند.این اجزا که در سیتوپلاسم بعضی سلولها قرار دارند با این رنگ آمیزی قرمز رنگ میشوند

• اجزاوساختمان هایی که ترکیبی ازدو رنگینه هم رنگینه اسیدی هم رنگینه بازی را به خود راه میدهند نوتروفیلیک(خنثی دوست ) می نامند .

یکی از پرکاربرد ترین محلول های رنگ آمیزی برای سلول های خونی ، رنگ های رومانوفسکی است. این دسته از رنگ ها دارای دو جزء اساسی بازی(متیلن بلو) و اسیدی(ائوزین یا آزور) است.

رنگ های رومانوفسکی به 4دسته زیر تقسیم می شوند:

1.رنگ گیمسا

2.رنگ لیشمن

3.رنگ رایت

4.رنگ Field’s

خاصیت مهم رنگ های گروه رومانوفسکی:

تفکیک دقیق سلولها

درجه رنگ پذیری و رنگ آمیزی تفکیکی گرانولهای سلولها

عوامل موثر بر رنگ آمیزی:

مدت رنگ آمیزی

غلظت رنگ

PH محلول

Y به ائوزین B نسبت آزور

دراین مقاله به بررسی رنگ آمیزی گیمسا میپردازیم

رنگ آمیزی گیمسا چیست؟

گیمسا به عنوان یکی از رایج‌ ترین و محبوب ترین رنگ آمیزی میکروسکوپی در دنیا شناخته می شود.  در واقع گیمسا مخلوط استاندار شده ای از رنگ های مخلوط بازی (آزور، و متیلن بلو) و اسیدی ( ائوزین) است که اولین بار توسط شیمی دان آلمانی به نام گوستاو گیمسا ساخته شد. گاوستاو گیمسا از محلول بدست امده برای اولین بار در پروژه تحقیقاتی انگل ایجاد کننده مالاریا استفاده کرد. فرمول شیمیایی گیمسا C14H14ClN2S بوده و جرم مولکولی آن 291.8 گرم بر مول است.

۱- رنگینه متیلن بلو

۲- رنگینه ائوزین .

رنگینه متیلن آبی خاصیت بازی دارد. رنگینه متیلن آبی که خاصیت بازی دارد , قسمتهای اسیدی سلول را رنگ می کند. قسمت اسیدی سلول مثل هسته سلول است به خاطر وجود نوکلئیک اسید(اسیدهای هسته ای) هسته سلول ها خاصیت اسیدی دارند.با این رنگ هسته سلول ها آبی تیره متمایل به بنفش میشه.

رنگ ائوزین ساختار های بازی سلول را رنگ میکنه. رنگ ائوزین مثلا دانه های موجود در سیتوپلاسم سلول را رنگ میکنه. دانه هائی که خاصیت بازی دارند. با رنگ ائوزین به رنگ نارنجی درمیآیند. به عنوان نمونه دانه های موجود در سلول های ائوزینوفیل که با رنگ آمیزی گیمسا به رنگ نارنجی درمیآیند.

رنگ گیمسا به دلیل ساختار منحصر به فرد خود در بسیاری از بخش های مختلف آزمایشگاهی(هماتولوژی،سیتولوژی، هیستولوژی،میکروبیولوژی و…) کاربرد داشته و به عنوان رنگ همه کاره از آن یاد می شود.

کاربرد رنگ آمیزی گیمسا

• رنگ آمیزی سلول های خونی(شمارش گلبول های سفید و تمایز بین سلول های مختلف خون)

• رنگ آمیزی کروموزوم و شناسایی انحرافات کروموزومی

• شناسایی مالاریا و یا سایر انگل های خونی

• رنگ آمیزی کپسول های کلبسیا، پنوموسیستیسر جیرووسی، هیستوپلاسما کپسولاتوم

• رنگ آمیزی نمونه های بافتی(لوزه، طحال، معده و مغز استخوان)

روش تهیه رنگ گیمسا در آزمایشگاه

• تعدادی از مهره های شیشه ای که توسط الکل تمیز شده را در بطری شیشه ای درپیج دار، تیره رنگ، خشک و عاری از هرگونه مواد شیمیایی بریزد.

• مقداری از پودر گیمسا(3.8گرم) را با استفاده از ترازو آزمایشگاهی وزن کرده و توسط قیف داخل بطری حاوی مهره های شیشه ای با دقت بریزید.

• 100میلی لیتر متانول را توسط قیف به بطری اضافه کنید.

• درب بطری را بسته و به مدت 2-3 دقیقه به صورت دورانی بطری را تکان دهید تا پودر گیمسا به آرامی در متانول حل شود.

• 250 میلی لیتر گلیسرول موجود را به محلول فوق(متانول و گیمسا) اضافه کرده و مجددا به مدت 3-5 دقیقه به خوبی مخلوط کنید.

• 150میلی لیتر باقی مانده از متانول را به آرامی به مخلوط اضافه کرده به نحوی که تمامی قطرات گلیسرول موجود در قیف پاک شده و درون بطری در پیچ دار ریخته شود.

•  مخلوط حاصل را به مدت 7روز(حداقل) روزی 6 بار به مدت 2-3 دقیقه با استفاده از شیکر مخلوط کنید.

• در نهایت محلول رنگ گیمسا آماده بوده و با استفاده از لیبل تاریخ تولید، انقضا و شخص تهیه کننده را مشخص کنید.

مراحل آماده سازی اسلاید نمونه

1.یک قطره خون از توسط لوله مویین از لوله آزمایش برداشته و بر روی لام آزمایشگاهی تمیز قرار دهید.(درصورتی که از نمونه خون پاشنه ای یا انگشت استفاده می کنید، اولین قطره خون را دور بریزید)

2.با استفاده از لام تمیز دیگری قطره خون ریخته شده را به آرامی پخش کنید(زاویه لامل 30تا 45 درجه نسبت ببه سطح لام باشد)

3.اجازه دهید لام در معرض هوا کاملا خشک شود

4.تمامی قسمت های نمونه روی لام را به متانول آغشته کرده و اجازه دهید کاملا خشک شود.(جهت فیکس یا تثبیت شدن نمونه)

5.نمونه را به محلول گیمسا که به نسبت 1:20 رقیق شده به مدت 20 دقیقه آغشته کنید(برای رقیق شدن محلول گیمسا از بافر فسفات استفاده کنید)

6.پس از گذشت 20 دقیقه لام را با مقدار آب مقطر شست و شو دهید.(از شست و شوی بیش از حد خودداری کنید زیرا باعث بی رنگ شدن لکه خونی می شود)

7.لام را در معرض هوا قرار داده تا کاملا خشک شود.(از خشک کردن نمونه در دستگاه انکوباتور اجتناب کنید)

8.نمونه را جهت بررسی میکروسکوپی بر روی میکروسکوپ قرار داده و با لنز 40 یا 100 می توانید اجزای سلولی نمونه را بررسی نمایید.

نتایج مشاهدات میکروسکوپی نمونه مورد بررسی

آبي رنگ شدن بيش از اندازه:

• گسترشهاي ضخيم

•  طولاني شدن زمان رنگ‌آميزي

• شستشوي ناكافي

• نمونه هپارینه

• افزایش پروتئین های خون

• افزایش فوق العاده سلولهای بلاست

•  يا قليايي بودن خيلي زياد رنگ يا محلول

• در اين گسترشها، اريتروسيتها آبي يا سبز رنگ ميگيرند، كروماتين هسته آبي تيره يا سياه و گرانولهاي نوتروفيلها بيش از اندازه رنگ ميگيرند و برجسته به نظر مي‌آيند. گرانولهاي آئوزينوفيلها آبي يا خاكستري هستند.

صورتي رنگ شدن بيش از اندازه:

• رنگ‌آميزي ناكافي

•  افزايش زمان شستشو

• EDTAبیشتر از حجم خون

•  قرار دادن لاملها قبل از خشك شدن آنها

•  يا بالا بودن قدرت اسيدي رنگ يا بافر

• قرار گرفتن رنگ يا بافر در معرض بخارات اسيدي

• به علت زياد ماندن متيل الكل و تمايل به توليد اسيد فرميك

• اريتروسيتها قرمز درخشان يا نارنجي هستند، كروماتين

• هسته آبي كم‌رنگ است و گرانولهاي ائوزينوفيلها قرمز درخشان هستند