روش پورپلیت (Pour Plate Method) یک تکنیک پرکاربرد در اغلب آزمایشگاه‌ها به ویژه آزمایشگاه‌های داروسازی، بالینی و صنایع غذایی است. این روش برای شمارش تعداد باکتری‌های خاص موجود در یک نمونه مورد استفاده قرار میگیرد. فرآیند انجام روش پورپلیت شامل مراحل روتین آزمایشگاهی (مانند ذوب کردن، حجم‌برداری و انکوباسیون) است که ممکن است ساده به نظر برسد اما بر اساس بررسی‌های انجام شده بسیاری از کاربران آزمایشگاهی برای انجام این روش دچار مشکلاتی هستند. به همین دلیل در این مطلب قصد داریم تا ضمن ارائه توضیحاتی در رابطه با روش پورپلیت و هدف انجام آن، فرایند کشت ارگانیسم‌ها به روش پورپلیت را نیز بیان کنیم. پس در ادامه با ما همراه باشید.
مروری بر روش پورپلیت برای کشت ارگانیسم‌ها
روش پورپلیت که امروزه در آزمایشگاه‌های باکتریولوژی کاربرد گسترده‌ای دارد در ابتدا توسط فردی به نام رابرت کخ (Robert Koch) ابداع شد. در نمونه‌هایی که دارای جمعیت میکروبی و مخلوطی از انواع سلول‌ها هستند، می‌توان از روش پورپلیت برای تولید یک کشت خالص از میکروارگانیسم‌های موجود در این جمعیت میکروبی استفاده کرد. به طور کلی می‌توان گفت که هدف اصلی از انجام روش پورپلیت، جدا کردن یک کشت خالص از مخلوطی از جمعیت‌های میکروبیِ مختلف و نشان دادن مشخصات باکتری‌ها از جمله رنگ، بافت، اندازه، ارتفاع و غیره است.
این روش همچنین برای شمارش تعداد موجودات زنده در مایعات مانند آب، شیر، ادرار یا کشت آبگوشت و همچنین تعیین فعالیت همولیتیک کلنی‌های عمیق برخی از باکتری‌ها مانند استرپتوکوک‌ها با استفاده از یک محیط آگار حاوی خون کاربرد دارد.
شمارش باکتری‌ها به روش پور پلیت دقیق‌تر از روش کشت خطی است، اما به طور متوسط، میزان شمارش کمتری را ارائه می‌کند زیرا میکروارگانیسم‌های حساس به گرما در صورت تماس با محیط گرم و آگار مذاب ممکن است از بین بروند.
روش غیر مستقیم یا pour plate
ماده ی واجد باکتری را بصورت سری رقیق میکنیم وسپس آن رابرروی سطح محیط کشت جامدکشت می دهند هرکلونی تولیدشده مجموعی ازباکتری هاست که ازتقسیم یک باکتری بوجودآمده وکلونی تولیدشده درسطح محیط کشت که حداقل مربوط به یک باکتری است را شمارش می کنیم و از این طریق تعداد باکتری های زنده شمارش می شوند.
شرح آزمایش به روش غیر مستقیم:
- در 8عدد لوله‌ی آزمایش دربسته 9 میلی لیتر سرم فیژیولوژی ریخته و آن را استریل کنید.
- لوله‌ها را از 1 تا 8 شماره‌گذاری کنید و به ترتیب درون جا لوله‌ای قرار دهید.
- از نمونه‌ی اولیه سوسپانسیون باکتری که می‌خواهید باکتری‌های آن را بشمارید یک میلی‌لیتر در شرایط استریل (کنار شعله یا زیر هود) به لوله‌ی شماره‌ی 1 منتقل کنید.
- محتوای لوله‌ی اول را خوب مخلوط کنید تا رقت –10 شما کاملاً یک نواخت گردد.
- سپس 1 میلی‌لیتر از آن را در شرایط استریل به لوله‌ی بعدی منتقل کنید.
- مرحله‌ی قبل را به ترتیب برای لوله‌های بعدی تکرار کنید تا رقت 8-10 به دست آید.
- از آخرین لوله 1cc را بیرون ریخته تا تمام لوله آزمایش ها 9 cc باشند. هر چه رنگ کم‌رنگ‌تر می‌شود نشان‌دهنده‌ی رقیق‌تر شدن سوسپانسیون اولیه است.
- حال که رقت ها را تهیه کردیم ، نوبت به کشت آنها می رسد. برای هر رقت یک پلیت استریل مشخص می کنیم. از هر لوله مقدار 0/1 ml برداشته و به داخل پلیت های مربوط به آن رقت می ریزیم .
- پس از این کار حدودا 15cc از محیط نوترینت آگار را در هر پلیت می ریزیم . دمای محیط کشت نباید زیاد باشد تا میکروارگانیسم ها کشته شوند ؛ تقریبا حدود 45 تا 50 درجه سانتیگراد.
- پلیت ها را 5 مرتبه به شکل 8 حرکت می دهیم تا محلول یکنواخت شود. سپس آنها را بی حرکت می گذاریم تا بسته شود.
- پلیت ها را باید علامت گذاری کنیم
- پلیت ها را در انکوباتور 32 درجه به مدت 48 ساعت قرار دادیم.
- بعد از رشد کلونی ها نوبت به شمارش آنها می رسد. برای دقت در کار بهتر است که تمام پلیت ها را شمارش کنیم.
روش محاسبه:
فاکتور رقت برابرباعکس رقت نمونه است
وسیله بعدبرای شمارش باکتری(کلنی ها)توسط کلنی کانترصورت میگیرد
پلیت رابه 4 قسمت تقسیم کرده ودریک ربع کلنی ها را شمارش میکنیم وبعد در چهارضرب میکنیم واگرتعدادکلنی ها رابین 30تا300 باشدشمارش ما درست بوده است.
240000=1000×240 =4×60
ازمعایب روش مستقیم:
- باکتری های زنده و غیر زنده با هم شمارش می شوند
- رقیق کردن با کاهش تعداد میکروارگانیسم ها همراه است
- به جای شمارش باکتری ها شمارش کلنی صورت می گیرد
- خیلی از باکتری ها قادر به رشد در محیط مصنوعی نیستند مثل باکتری تثبیت کننده نیتروژن
