سانتریفیوژ آزمایشگاهی

سانتریفیوژ Centrifuge از تجهیزات عمومی آزمایشگاهی است و  برای جدا کردن ذرات از محیط مایع به وسیله رسوب دادن آنها به کار می­روند. اساس فیزیکی جداسازی اعمال نیروی گریز از مرکز (centrifugal force) بر روی ذرات در حال دوران است که با شعاع میدان دوران و سرعت دوران نسبت مستقیم دارد. ذرات سنگین ­تر زودتر رسوب می­کنند و بقیه ذرات برحسب وزن مخصوص خود رسوب می­کنند. سانتریفیوژی که دارای شعاع کمتر است، باید نسبت به سانتریفیوژی که شعاع بیشتری دارد، با سرعت بیشتری بچرخد تا همان نیروی سانتریفیوژ نسبی (RCF) را ایجاد کند. سانتریفیوژهای آزمایشگاه تشخیص طبی، دستگاهی هستند که بوسیله نیروی چرخش دورانی الکتروموتور باعث ته­ نشین شدن مواد مختلف یک مخلوط یا محلول بر اساس اختلاف وزن مولکولی آنها می­شود.

اگر این دستگاه مجهز به شاخک­های نگه­دارنده لوله باشد، آن را سانتریفیوژ معمولی و اگر مجهز به دیسک یا صفحه دایره­ای شکل مخصوص جاگذاری لوله­ های موئین باشد آن را سانتریفیوژ میکرو یا هماتوکریت گویند.

به­ طور کلی مبنای اصلی سانتریفیوژ اصل گریز از مرکز است. در حقیقت سانتریفیوژ به کمک نیروی گریز از مرکز، ذرات سوسپانسیون را از مایع آن جدا می­کند. همچنین می­تواند باعث تفکیک دومایع با تراکم متفاوت گردد. این مایعات می­توانند مایعات بد نباشند(مانندخون، سم و ادرار).

تاریخچه سانتریفیوژ

اوایل قرن بیستم پوسترهای تبلیغاتی برای جداسازی مواد لبنی از شیر دیده می شد. مهندس نظامی انگلیسی بنیامین رابینر ( 1707 – 1751 ) یک دستگاه بازوی چرخان برای تعیین کشش اختراع کرد. در سال 1864، آنتونین پرانتل ایده یک سانتریفیوژ لبنی برای جداسازی خامه از شیر را مطرح کرد. این ایده بعدا توسط برادرش، الکساندر پرانتل، در جهت بهبود طراحی قبلی توسعه داده شد و یک نمونه دستگاه استخراج چربی کره در سال 1875 به نمایش گذاشته شد.

نحوه کار با سانتریفیوژ آزمایشگاهی

نحوه کار این دستگاه به گونه ای است که با قرار دادن نمونه، درون لوله سانتریفیوژ، دستگاه با سرعت ثابتی شروع به چرخش می کند و نمونه را به سمت خارج حرکت می دهد تا جایی که بصورت افقی قرار گیرد. در اینصورت نیروی گریز از مرکز سعی در حرکت و راندن محلول بر خلاف مرکز سانتریفیوژ را دارد و همین امر باعث جدا سازی ذرات درشت تر از محلول می شود به گونه ای که در صورت متوقف کردن دستگاه ذرات سنگین تر در قسمت بیرونی بصورت جدا شده از محلول باقی می مانند.

به همین منظور امروزه سانتریفیوژ آزمایشگاهی به یکی از پرکاربردترین و مناسب ترین تجهیزات در آزمایشگاه های تحقیقاتی، بیولوژیکی، شیمی، علوم زیستی، پزشکی و دارو سازی، صنایع غذایی، آشامیدنی و تحقیقات مواد پلیمری تبدیل شده اند.

تصویر 1. نحوه عملکرد سانتریفیوژ

تقسیم­ بندی سانتریفیوژها

الف – تقسیم­ بندی براساس سرعت:

1- سانتریفیوژهای با دور بالا

2- سانتریفیوژهای با دور پایین

3- اولترا سانتریفیوژها

_ در گروه اول یعنی سانتریفیوژهای با دور بالا، سرعت دور تند بین 24000-21000 rpm  دور در دقیقه تا حداکثر 30000 rpm می­باشد. از این سانتریفیوژها بیشتر جهت تهیه فرآورده­ های خونی استفاده گشته و همگی یخچال­دار هستند. دو نوع سانتریفیوژ با دور بالا وجود دارد:

✔ سانتریفیوژ کم ظرفیت

✔ سانتریفیوژ پر ظرفیت

سانتریفیوژهای کم ظرفیت مدل Discrete Sampling می­توانند میکروارگانیسم ­ها، سلول­ ها، ویروس ­ها و اورگانل ­های سلولی را جدا نمایند. سانتریفیوژهای پرظرفیت مدل Continuos Flow برای جداسازی مخمرها، باکتری­ ها و ویروس­ ها از محیط کشت، پروتئین­ ها و باکتریوفاژها از نمونه­ های رقیق شده کاربرد دارند.

_ در گروه دوم یعنی سانتریفیوژهای با دور پایین، دور دوران بین  6000-2000 rpm تا حداکثر 8000 rpm بوده و در هر دو نوع یخچال­دار و بدون یخچال موجود می­باشند. بیشتر جهت سانتریفیوژ کردن سلول­های خونی یا ذرات حجیم استفاده شده و برای جداسازی ذرات ریز سرعت آنها کافی نیست.

_ در اولتراسانتریفیوژها معادل 100000-75000 rpm تا حداکثر 120000 rpm می­باشد. اولترا سانتریفیوژها برای تفکیک مواد تشکیل­ دهنده سلولی کاربرد داشته و همگی دارای یخچال می­باشند. زیرا در دورهای بالا اصطحکاک هوا باعث گرم شدن دستگاه شده و در نتیجه منجر به تخریب پروتئین­ها خواهد شد. اولتراسانتریفیوژها به طور معمول در مراکز تحقیقاتی استفاده می­شوند.

ب – تقسیم­ بندی براساس شناور، زاویه ثابت و محوری بودن:

✅ سانتریفیوژهای شناور Horizontal /Swing bucket /Swing out head

در این نوع سانتریفیوژها (سانتریفیوژهای شناور)، جایگاه قرار گرفتن نمونه­ها طبق نیروی ثقل عمود بر زمین بوده، اما با شروع حرکت، ابتدا از حالت عمودی خارج شده و زاویه پیدا می کند. سپس کاملاً شناور گشته و طبق نیروی گریز از مرکز به سمت خارج و به حالت افقی با سطح زمین درمی­آیند. لذا به آن نوع شناور یا swing گفته می­شود. به طور خلاصه دراین نوع سانتریفیوژ در حالت توقف وضعیت عمودی و در حالت دوران نمونه­ ها وضعیت افقی با سطح زمین دارند.

در این نوع سانتریفیوژ ذرات معلق بر اثر نیروی گریز از مرکز به بخش خارجی یعنی انتهای لوله­ها رانده شده و رسوب به صورت یک لایه تقریباً یکنواخت در ته لوله تشکیل می­گردد. در پایان عمل لوله­های حاوی نمونه مجدداً به حالت عمودی درآمده، رسوب در ته لوله و محلول شفاف در بالای آن قرار م­ گیرد. می­توان با پیپت پاستور یا سمپلر، مایع فوقانی را از رسوب جدا کرد. در صورتی که دور سانتریفیوژ بالا باشد و یا زمان دوران افزایش یابد، می­توان حتی رسوب را از محلول فوقانی جدا کرد.

✅ سانتریفیوژهای زاویه ثابت Fixed angle / Angle head

لوله حاوی نمونه نسبت به محور دوران یک زاویه ثابت دارد. این زاویه از 25 تا 45 درجه می­تواند متغیر باشد. در این نوع سانتریفیوژ نیز ذرات معلق بر اثر نیروی گریز از مرکز به سمت خارج از محور دوران رانده می­شوند. اما برخلاف سانتریفیوژهای شناور، رسوب در جدار و بخشی از کف لوله که در قسمت خارجی محور دوران قرار دارد، رانده می­شود.البته هر قدر این زاویه نسبت به محور دوران کمتر باشد، رسوب بیشتر در جداره تشکیل می­گردد و اگر زاویه بیشتر باشد، رسوب بیشتر در کف تشکیل می­گردد. از آنجایی که شکل آئرودینامیک چرخاننده اجازه دوران در دور بالاتر و رسوب ذرات ریزتر را می­دهد، لذا میزان رسوب­دهی این نوع سانتریفیوژها ازنوع شناور بالاتر است.

✅ سانتریفیوژهای محوریAxial

در واقع، لوله حاوی نمونه در طول محور عمودی خود دوران می­کند ( بر خلاف سانتریفیوژهای معمولی که در طول محور افقی دوران می­کنند.) این دستگاه­ها به طور تجاری برای مقاصد بالینی در دسترس می­باشند. معمولاً خون بیمار در لوله­های سپتوم­دار وکیوم شده، نمونه­ گیری گشته، سپس در جایگاه مخصوص خود به نام Axial Separation Module قرار داده شده و به طور خودکار در طول محور عمودی خود شروع به دوران می­کند. ممکن است یک سوزن از طریق درب پلاستیکی ( سپتوم ) داخل لوله شده و از قسمت مرکزی، نمونه شفاف شده را برداشت کند. در این روش ذرات معلق که می­توانند سلول­های خونی باشند، به قسمت محیطی لوله­ ها رانده می­شوند. در انواع تجاری این دستگاه­ها کل فرآیند جداساز در طی 70 ثانیه کامل می­گردد که زمان مناسبی می­باشد.

انواع سانتریفیوژهای موجود در آزمایشگاه ­ها

1- سانتریفیوژ سایتولوژی

از این نوع سانتریفیوژ برای قرار دادن سلول­های موجود در یک مایع روی اسلاید میکروسکوپ استفاده می­شود. در موقع استفاده کاربر ظرف مخصوص نمونه، صفحه فیلتر و یک اسلاید را کنار هم قرارمی­دهد. سپس همگی را در داخل روتور گذاشته مایع مورد نظر را در ظرف مخصوص نمونه قرار داده و دستگاه را روشن می­کند. بعد از فعال شدن دستگاه، مایع با فشار در تماس با مجموعه فیلتر / اسلاید قرار می­گیرد.

معمولاً سانتریفیوژها با دور 4000-200 rpm کار کرده و زمان سانتریفیوژ 99-1 دقیقه متغیر است.

تصویر 2. سانتریفیوژ سایتولوژی

2- سانتریفیوژ میکروهماتوکریت

سانتریفیوژ میکروهماتوکریت با استفاده از نیروی گریز از مرکز هماتوکریت خون (نسبت حجم یاخته­های سرخ به کل حجم خون ) را مشخص می­کند. این نوع سانتریفیوژها دارای روتوری می­باشند که لوله­های موئین حاوی نمونه به صورت افقی روی آن قرار می­گیرند. بعد از انجام سانتریفیوژ با استفاده از یک صفحه درجه­بندی شده، مقدار هماتوکریت بدست می­ آید.

تصویر 3. سانتریفیوژ میکروهماتوکریت

3- میکروسانتریفیوژ ها

از این نوع سانتریفیوژها برای نمونه­های با حجم کم غالباً کمتر از 1.5 ml ( مانند نمونه ­های گرفته شده از اطفال ) استفاده می­شود. میکروسانتریفیوژها در مدل­های با دور پایین و دور بالا ساخته می­شوند. در دور پایین حداکثر سرعت 13000 rpm بوده و برای خون و سایر محصولات خونی کاربرد دارد. در مدل­های با دور بالا حداکثر سرعت به 28000 rpm نیز رسیده و برای جمع­آوری سلول­ها و میکروارگانیسم­ها و بررسی ارگانل­های سلولی کاربرد دارند. غالباً لوله­هایی که در میکروسانتریفیوژها استفاده می­شوند ازجنس پلاستیک و یکبار مصرف بوده، دارای یک سطح مقطع مخروطی و دارای سرپوش می­باشند.

تصویر 4. میکروسانتریفیوژ

4- سانتریفیوژهای شستشودهنده سلول

از این نوع سانتریفیوژ جهت شستشو، دکانته کردن، مخلوط کردن و شستشوی مجدد یاخته­های قرمز خون قبل از آزمایشات متعددی چون Antiglobulin استفاده می­شود.

تصویر 5. سانتریفیوژ  شستشو دهنده سلول

5- سانتریفیوژ های رومیزی کلینیکال

سانتریفیوژهای با سرعت پایین برای جداسازی اجزا خون کامل شامل سرم ، پلاسما ، گلبول های قرمز خون و دیگر مایعات بدن مناسب است. سرعت آن می تواند از rpm 200 تا 6000 rpm تغییر کند. بیشتر سانتریفیوژ های کلینیکال می توانند انواع مختلف از تیوب های خون را در خود جا دهند.

تصویر 6. سانتریفیوژ کلینیکال

6- سانتریفیوژ های رو میزی یخچال دار

این نوع سانتریفیوژ برای جداسازی نمونه های حساس به دما مانند پروتئین ها و سلول های زنده مناسب است . پروتئین ها در دمای بالا تخریب می شوند و باعث همولیز شدن نمونه می شوند. قادر به ثابت نگه داشتن دما می باشد. این مدل از سانتریفیوژ در ابعاد و اندازه های متنوع و ظرفیت های مختلف تولید و عرضه می شود.

✔ برخورداری از سیستم خنک کننده به منظور محافظت و جلوگیری از تخریب نمونه (چرا که این دستگاه در حین انجام عملیات و چرخیدن، گرمای و حرارت زیادی تولید می نماید که باعث تغییر در ماهیت نمونه ها می شود.)

✔ برخورداری از سرعت چرخشی بالا (۳۰۰۰۰ دور در دقیقه)

✔ دارا بودن محدوده دمایی بین ۲۰ الی ۴۰ درجه سانتی گراد (این دستگاه با برخورداری از این محدوده دمایی برای انجام و آنالیز کردن پادتن، DAN، RNA، PCR مناسب می باشد.)

✔ داشتن پیکر بندی روتور شناور (زاویه ثابت یا Swing)

تصویر 7. سانتریفیوژ یخچال دار

اجزای دستگاه سانتریفیوژ

1- موتور الکتریکی

2- روتور یا هدسانتریفیوژ

3- تایمر

4- شافت

5- سر روتور

6- کلید خاموش و روشن کردن دستگاه

7- ترمز ( Brake) که دور عکس می­زند.

8- کنترل کننده سرعت ( Potentiometer )

9- Tachometer (سرعت­ سنج) که دور سانتریفیوژ را نشان می­دهد.

روتور که لوله های حاوی نمونه را در آن جای می­دهند با سرعت تنظیم شده توسط موتور چرخیده و ممکن است از جنس استیل، برنز و یا حتی پلاستیک باشد.

ایمنی و نگه­داری

✔ به منظور پیشگیری از بروز نوسانات جریان الکتریکی، دستگاه باید به سیستم تثبیت کننده جریان برق (UPS ) مجهز شود.

✔ ذغال دستگاه باید هر سه ماه یک بار بازدید و هر 6 ماه یک بار تعویض گردد.

✔ واشر دور حلقه محیطی دستگاه باید همیشه تمیز باشد.

✔ دستگاه باید در جای محکم قرار گیرد تا ضربات وارده به پایه دستگاه در حال چرخش باعث خرابی دستگاه و همچنین کم شدن دقت آن نشود.

✔ در هنگام باز کردن درب سانتریفیوژ و برداشتن لوله­ های موئینه باید مواظب بود، زیرا لوله­ های شکسته شده به قطعات ریزی تبدیل گشته و بعضاً با چشم قابل دید نیستند.

✔ در صورتی که عجله­ای برای خواندن نتیجه وجود ندارد، بهتر است برای جلوگیری از شکل­گیری آئروسل، درب سانتریفیوژ را 5 تا 10 دقیقه بعد از توقف دستگاه بار نمائید.