روش رنگ امیزی کریستال ویوله LIEBبرای دیدن آمیلوئید ها:
کریستال ویوله یک نمک کلرید آلی است که به دسته رنگ‌های قلیایی تری‌فنیل‌متان تعلق دارد.
این نمک مونوکلراید که نام علمی آن هگزامتیل کلراید آنیلین رز است، کاربردهای زیستی و صنعتی گسترده‌ای دارد که از این کاربردها می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:
- به عنوان جوهر یا برای ثبت اثر انگشت
- به عنوان یک ماده ضد قارچ، ضد باکتری و ماده ضد التهاب
- به عنوان یک رنگ هیستولوژی برای رنگ‌آمیزی بافت
این نمک به شکل پودری وجود دارد و رنگ آن در حالت پودری سبز تیره با براقیت فلزی است اما هنگام حل شدن در آب یا الکل به رنگ بنفش درمی‌آید. میزان تیرگی و روشنی (تنالیته) رنگ بنفش، به میزان اسیدیته محلول مورد نظر بستگی دارد. ایجاد رنگ بنفش تیره یا روشن به دلیل بارهای مختلف موجود در مولکول‌ها می‌باشد.
کریستال ویوله با نام‌های دیگری نیز شناخته میشود. اسامی مترادف کریستال ویوله عبارتند از:
Basic Violet 3، Gentian Violet، Hexamethyipararosaline chloride، Methyl Violet 10B
در این مقاله قصد داریم رنگ‌آمیزی آمیلوئیدها با استفاده از کریستال ویوله LIEB را بگوییم اما قبل از آن لازم است با تاریخچه این رنگ بیش‌تر آشنا شوید.
تاریخچه:
رنگ کریستال ویوله یکی از اجزای متیل ویوله است.کریستال ویوله ابتدا توسط آلفرد کرن ساخته شد.
جاکوب استیلینگ چشم‌پزشک آلمانی بوده که در سال ۱۸۹۰ خواص ضدعفونی کننده کریستال ویوله را کشف کرد.
بعدها در سال ۱۹۰۲افرادی با نام های کنرادی و دریگالسکی متوجه شدند که این رنگ روی باکتری‌های گرم مثبت تاثیر زیادی دارد و اثر آن روی باکتری‌های گرم منفی مانند بسالمونا تیفی سیار کم است.
مواد مورد نیاز:
فیکساتیو: بافر فرمالین %۱۰ (خنثی)
- محلول کریستال ویوله: مواد مورد نیاز رنگ کریستال ویوله(1.4gr) _الکل./.95(10ml) _آب مقطر(300ml) _اسید کلریدریک غلیظ(1ml)
- محلول مانت(پوشاننده): آکاسیا:50gr _ساکارز(شکر):50gr _آب مقطر:150ml _سدیم کلرید :10gr_ تیمول:0.1gr
آکاسیا و ساکارز و آب مقطر را با استفاده از یک هات پلیت در یک بشر ۵۰۰ میلی‌لیتری مخلوط کنید سپس محلول را در دمای ۵۸ تا ۶۰ درجه سانتی‌گراد گرم کنید. معمولا ۵ الی ۶ ساعت طول می‌کشد تا Acacia به طور کامل در محلول حل میشود. در صورت نیاز برای حفظ حجم محلول، به آن آب مقطر اضافه کنید. سدیم کلراید و تیمول را در محلول حل کنید سپس محلول را به وسیله کاغذ صافی‌های پشم شیشه‌ای فیلتر کنید.
محلول به دست آمده را در یخچال و در دمای ۳ تا ۶ درجه سانتی‌گراد نگهداری کنید. سدیم کلراید باعث جلوگیری از انتشار میشود. تیمول نیز به عنوان ماده نگهدارنده به محلول اضافه میشود.
بافت‌های پارافینی را در اندازه‌های ۶ میکرومتری برش دهید.
عکس صافی پشم شیشه ای
مراحل رنگ‌آمیزی:
برای این رنگ‌آمیزی از لام‌های کنترلی استفاده کنید.
۱- بافت را دپارافینه کنید سپس هیدراسیون با آب مقطر را انجام دهید.
۲- لام‌ها را با محلول کریستال ویوله رنگ‌آمیزی کنید و اجازه دهید رنگ به مدت ۵ دقیقه روی آن باقی بماند.
۳- لام‌ها را به مدت ۵ دقیقه زیر شیر آب شست و شو دهید و سپس آن‌ها را با آب مقطر بشویید.
۴- لام‌ها را با محلول مانت (پوشاننده) Apathy بپوشانید و لامل را روی ان قرار می دهیم.
چیزی که مشاهده میکنیم : آمیلوئید ها به رنگ بنفش ارغوانی دیده می شود و سایر عناصربافت به رنگ آبی دیده می شود.
2نمونه از نتایج رنگ آمیزی بافت ها با رنگ کریستال ویوله در زیر آورده ایم.
آمیلوئید رنگ آمیزی شده با کریستال ویوله
رشد بیش از حد سلول‌های کلنی (ES) در لایه تغذیه‌ای فیدر، بعد از رنگ آمیزی با رنگ کریستال ویوله. (بزرگنمایی ۴۰X)
نکاتی که باید بدانیم :
از آنجا که برای ساخت محلول مانت (پوشاننده) علاوه‌بر فرمول اصلی، ساکارز و سدیم کلرید نیز به آن اضافه شده است، انتشار رنگ در آن رخ نمی‌دهد.
*در این روش (رنگ‌آمیزی با محلول کریستال‌ویوله) همه انواع آمیلوئیدها مانند روش کنگو‌رد ، رنگ‌آمیزی نمی‌شوند اما این روش معمولا آمیلوئید های موجود در عضله‌ی قلب را بهتر از روش کنگو‌رد نشان می‌دهد.
