ایمنی در آزمایشگاه

روش رنگ‌آمیزی کریستال ویوله LIEB برای نمایش دادن آمیلوئیدها

کریستال ‌ویوله یک نمک کلرید آلی است که به دسته رنگ‌های قلیایی تری‌فنیل‌متان تعلق دارد.

این نمک مونوکلراید که نام علمی آن هگزامتیل کلراید آنیلین رز است، کاربردهای زیستی و صنعتی گسترده‌ای دارد که از این کاربردها می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:

 

  • به عنوان جوهر یا برای ثبت اثر انگشت
  • به عنوان یک ماده ضد قارچ، ضد باکتری و ماده ضد التهاب
  • به عنوان یک رنگ هیستولوژی برای رنگ‌آمیزی بافت

این نمک به شکل پودری وجود دارد و رنگ آن در حالت پودری سبز تیره با براقیت فلزی است اما هنگام حل شدن در آب یا الکل به رنگ بنفش درمی‌آید. میزان تیرگی و روشنی (تنالیته) رنگ بنفش، به میزان اسیدیته محلول مورد نظر بستگی دارد. ایجاد رنگ بنفش تیره یا روشن به دلیل بارهای مختلف موجود در مولکول‌ها می‌باشد.

کریستال ویوله با نام‌های دیگری نیز شناخته می‌شود. اسامی مترادف کریستال ویوله عبارتند از:

Basic Violet 3 ، Gentian Violet ، Hexamethyipararosaline chloride، Methyl Violet 10B

در این مقاله قصد داریم رنگ‌آمیزی آمیلوئیدها با استفاده از کریستال ویوله LIEB را بیان کنیم اما پیش از آن لازم است با تاریخچه این رنگ بیش‌تر آشنا شوید.

 

تاریخچه

رنگ کریستال ویوله یکی از اجزای متیل ویوله است. کریستال ویوله ابتدا توسط آلفرد کرن ساخته شد. او برای سنتز این محلول با یک شیمی‌دان آلمانی به نام هنریش کارو همکاری کرد.

جاکوب استیلینگ، چشم‌پزشک آلمانی، در سال ۱۸۹۰ خواص ضدعفونی کننده کریستال ویوله را کشف کرد. بعدها در سال ۱۹۰۲ کنرادی و دریگالسکی متوجه شدند که این رنگ روی باکتری‌های گرم مثبت تاثیر زیادی دارد و اثر آن روی باکتری‌های گرم منفی مانند سالمونا تیفی بسیار کم است.

 

مواد مورد نیاز:

فیکساتیو: بافر فرمالین %۱۰ (خنثی)

محلول‌های مورد نیاز:

۱- محلول کریستال ویوله

 

مواد مورد نیاز 

مقدار مواد مورد نیاز

رنگ کریستال ویوله C.I42555 1.4 گرم
الکل 95%

10 میلی لیتر

آب مقطر

300 میلی لیتر

اسیدکلریدریک غلیظ

1 میلی لیتر

 

۲- محلول مانت (پوشاننده) Apathy

 

مواد مورد نیاز 

مقدار مواد مورد نیاز 

آکاسیا (صمغ عربی اقاقیا) 50 گرم
ساکارز(شکر) 50 گرم
آب مقطر 150 گرم
سدیم کلرید 10 گرم
تیمول 0.1 گرم

 

صمغ عربی اقاقیا (ساکارز و آب مقطر را با استفاده از یک هات پلیت در یک بشر ۵۰۰ میلی‌لیتری مخلوط کنید. محلول را در دمای ۵۸ تا ۶۰ درجه سانتی‌گراد گرم کنید. معمولا ۵ الی ۶ ساعت طول می‌کشد تا Acacia به طور کامل در محلول حل شود. در صورت نیاز برای حفظ حجم محلول، به آن آب مقطر اضافه کنید. سدیم کلراید و تیمول را در محلول حل کنید سپس محلول را به وسیله کاغذ صافی‌های پشم شیشه‌ای  فیلتر کنید.

کاغذ صافی‌های پشم شیشه‌ای

شکل ۱: کاغذ صافی پشم شیشه‌ای

 

محلول به دست آمده را در یخچال و در دمای ۳ تا ۶ درجه سانتی‌گراد نگهداری کنید. سدیم کلراید باعث جلوگیری از انتشار می‌شود. تیمول نیز به عنوان ماده نگهدارنده به محلول اضافه می‌شود.

 

تکنیک رنگ‌آمیزی:

بافت‌های پارافینی را در اندازه‌های ۶ میکرومتری برش دهید.

 

مراحل رنگ‌آمیزی:

برای این رنگ‌آمیزی از لام‌های کنترلی استفاده کنید.

 

۱- بافت را دپارافینه کنید سپس هیدراسیون با آب مقطر را انجام دهید.

 

۲- لام‌ها را با محلول کریستال ویوله رنگ‌آمیزی کنید و اجازه دهید رنگ به مدت ۵ دقیقه روی آن باقی بماند.

 

۳- لام‌ها را به مدت ۵ دقیقه زیر شیر آب شست و شو دهید و سپس آن‌ها را با آب مقطر بشویید.

 

۴- لام‌ها را با محلول مانت (پوشاننده) Apathy  بپوشانید و لامل را روی آن‌ها قرار دهید.

 

نتایج

 

پروتئین / بافت

رنگ مشاهده شده

آمیلوئید

بنفش ارغوانی

سایر عناصر بافت

آبی

 

دو نمونه از نتایج رنگ‌آمیزی بافت‌ها با رنگ کریستال‌ویوله را در زیر آورده‌ایم:

 

آمیلوئید رنگ‌آمیزی شده با کریستال‌ویوله

               شکل ۲: آمیلوئید رنگ‌آمیزی شده با کریستال ویوله

 

رشد بیش از حد سلول‌های کلنی‌ (ES) در لایه تغذیه‌ای فیدر

شکل ۳: رشد بیش از حد سلول‌های کلنی‌ (ES) در لایه تغذیه‌ای         فیدر، بعد از رنگ آمیزی با رنگ کریستال ویوله. (بزرگنمایی ۴۰X)

توضیحات:

 

* از آنجا که برای ساخت محلول مانت (پوشاننده) Apathy  علاوه‌بر فرمول اصلی، ساکارز و سدیم کلرید نیز به آن اضافه شده است، انتشار رنگ در آن رخ نمی‌دهد.

*در این روش (رنگ‌آمیزی با محلول کریستال‌ویوله) همه انواع آمیلوئیدها مانند روش کنگو‌رد ، رنگ‌آمیزی نمی‌شوند اما این روش معمولا آمیلوئیدهای موجود در عضله‌ی قلب را بهتر از روش کنگو‌رد نشان می‌دهد.

 

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *