تکنیک رنگ آمیزی گوموری اصلاح شده برای بررسی هیستولوژیکی رشتههای رتیکولر به کار می‌رود. عملکرد اصلی رشتههای رتیکولر حمایت از بافت بسیاری از اندام‌هاست. این الیاف به طور معمول در سراسر بدن به ویژه در کبد، گره لنفاوی، طحال و کلیه یافت می‌شوند.
در این مطلب قصد داریم شما را با مواد و محلول‌های مورد استفاده در تکنیک رنگ‌آمیزی گوموری اصلاح شده برای رشتههای رتیکولر آشنا کرده و روش این رنگ‌آمیزی و نتایج حاصل از آن را بیان کنیم. پس در ادامه با ما همراه باشید.
۱. مواد و محلول‌ها
۱-۱. فیکساتیو:
بافر فرمالین خنثی ۱۰% (بهتر است از فیکساتیو بوئن استفاده نشود).
۱-۲. نمونه:
قطعات پارافین گیری شده و برش خورده به ابعاد ۵ میکرومتر، بیوپسی مغز استخوان دکلسیفیه نشده (Undecalcified) که به ابعاد ۴ میکرومتر برش خورده و با پلاستیک قالب‌گیری شده است.
۱-۳. محلول‌ها:
۱-۳-۱. پتاسیم پرمگنات اسیدی شده
تاسیم پرمنگنات ————————– ۰/۳ گرم
آب مقطر———————————— ۱۰۰/۰ میلی‌لیتر
اسید سولفوریک————————— ۰/۲ میلی‌لیتر
این محلول حدودا برای ۲ روز مناسب است.
۲-۳-۱. پتاسیم متا بی‌سولفیت ۱%
پتاسیم متا بی‌سولفیت——————— ۰/۱ گرم
آب مقطر————————————- ۱۰۰/۰ میلی‌لیتر
۳-۳-۱. نیترات نقره ۱۰%
نیترات نقره———————————- ۱/۰ گرم
آب مقطر———————————– ۱۰/۰ میلی‌لیتر
در یخچال در دمای ۳ تا ۶ درجه سانتی‌گراد نگهداری شود.
۴-۳-۱. پتاسیم هیدروکسید ۱۰%
پتاسیم هیدروکسید——————- ۱۰/۰ گرم
آب مقطر——————————– ۱۰۰/۰ میلی‌لیتر
۵-۳-۱. محلول نقره آمونیاک
۲/۵ میلی‌لیتر از پتاسیم هیدروکسید ۱۰% را به ۱۰ میلی‌لیتر از نیترات نقره‌ی ۱۰% اضافه کنید. سپس آمونیوم هیدروکسید غلیظ را قطره قطره اضافه کرده و ظرف را به آرامی تکان دهید تا مواد به طور کامل حل شوند. در همین حالت که ظرف را تکان می‌دهید، با دقت نیترات نقره‌ی ۱۰% را قطره به قطره اضافه کنید و این کار را تا جایی ادامه دهید که محلول کمی تیره شود. در نهایت محلول را با آب مقطر ترکیب کرده و حجم محلول نهایی را به ۵۰ میلی‌لیتر برسانید. این محلول اگر در یخچال با دمای ۳ تا ۶ درجه‌ی سانتی‌گراد نگهداری شود، حدودا ۷ روز پایدار می‌ماند.
۶-۳-۱. فرمالین ۱۰%
فرمالدئید، ۳۸% تا ۴۰%——————۱۰/۰ میلی‌لیتر
آب مقطر———————————- ۹۰/۰ میلی‌لیتر
۷-۳-۱. کلرید طلا ۰/۲ %
کلرید طلا——————————— ۰/۲ گرم
آب مقطر——————————— ۱۰۰/۰ میلی‌لیتر
۸-۳-۱. سدیم تیو سولفات ۲ %
سدیم تیو سولفات——————– ۲ گرم
آب مقطر—————————— ۱۰۰/۰ میلی‌لیتر
۹-۳-۱. نوکلئار فست رد ۰/۱%
۰/۱گرم نوکلئار فست رد را به کمک گرما در ۱۰۰ میلی‌لیتر از محلول آلومینیوم سولفات ۵% حل کنید. بگذارید خنک شود، آن را تصفیه کنید و مقداری تیمول به عنوان نگهدارنده به آن اضافه کنید.
۲. نکات تکنیکی
- هر بار محلول نقره تازه درست کنید. هنگامی که محلول‌های نقره آمونیاک خشک شوند، می‌توانند قابل انفجار باشند. بلافاصله پس از استفاده، محلول نقره را با سدیم کلرید اشباع شده خنثی کرده و دفع کنید.
- ظروف شیشه‌ای (که برای آماده سازی محلول نقره استفاده شده است) را با محلول تمیز کننده‌ی ظروف شیشه‌ای تمیز کنید. قبل از استفاده، کاملا با شیر آب شست و شو دهید و برای شست و شوی نهایی از آب مقطر استفاده کنید.
- توجه داشته باشید که در هر مرحله مواد بیش از حد حل نشود زیرا این کار ممکن است حساسیت آزمایش را پایین آورد.
۳. فرآیند رنگ آمیزی
۱. مراحل پارافین زدایی و هیدراسیون با آب مقطر را انجام دهید.
۲. به منظور اکسیداز کردن، لام را به مدت ۳ دقیقه درون پتاسیم پرمنگنات اسیدی شده قرار دهید.
۳. لام را سه مرتبه با آب مقطر آبکشی کنید.
۴. سپس به مدت ۱ دقیقه با پتاسیم متا بی سولفات ۱% تقلیل کنید.
۵. با آب شیر آن را به مدت ۳ دقیقه شست و شو دهید و چهار مرتبه با آب مقطر آبکشی کنید.
۶. آن را به مدت ۲ دقیقه در محلول نقره آمونیاک قرار دهید.
۷. سه مرتبه با آب مقطر، آبکشی کنید.
۸. سپس به مدت ۱ دقیقه آن را در فرمالین ۱۰% تقلیل کنید.
۹. به مدت ۱ دقیقه با آب شیر شست و شو دهید و دو مرتبه با آب مقطر آبکشی کنید.
۱۰. به مدت ۳۰ ثانیه آن را درکلرید طلای % ۰/۲ قرار دهید.
۱۱. دو مرتبه با آب مقطر آبکشی کنید.
۱۲. آن را به مدت ۱ دقیقه در سدیم تیو سولفات ۲% قرار دهید.
۱۳. سپس با آب شیر شست و شو دهید و دو مرتبه با آب مقطر آبکشی کنید.
۱۴. لام را به مدت ۳ دقیقه در محلول نوکلئار فست رد% ۰/۱ قرار دهید تا بافت تغییر رنگ دهد.
۱۵. آن را سه مرتبه با آب مقطر آبکشی کنید.
۱۶. دهیدراسیون را در الکل های درجه‌بندی شده انجام دهید.
۱۷. سه یا چهار مرتبه آن را در زایلین قرار دهید تا تمیز شود.
۱۸. در نهایت لامل را با رزین مصنوعی بر روی لام فیکس کنید.
۴. نتایج رنگ آمیزی
رشتههای رتیکولر ———————————- مشکی
هسته‌ها ——————————————— قرمز
کبد انسان. رنگ آمیزی رتیکولر
نکات مهم در رنگ آمیزی گوموری اصلاح شده برای رشتههای رتیکولر
زمان آماده سازی محلول نقره آمونیاک لازم است مقدار بسیار کمی آمونیوم هیدروکسید استفاده شود. آمونیوم هیدروکسید جهت حل کردن رسوبات حاصل از افزودن پتاسیم هیدروکسید به نیترات نقره مورد استفاده قرار می‌گیرد. اگر بیش از حد از آن استفاده شود، نه تنها باعث رنگ‌آمیزی نامطلوب رشتههای رتیکولر می‌شود، بلکه احتمال دارد قطعات بافت از لام‌های میکروسکوپ جدا شوند.
اگر کریستال‌های نیترات نقره در دمای اتاق نگهداری شوند، به تدریج به رنگ بنفش مایل به خاکستری درمی‌آیند اما اگر در یخچال نگهداری شوند، حتی بعد از چندین سال هم این اتفاق نمی‌افتد. اگرچه محلول نیترات نقره که تغییر رنگ داده، قابل استفاده است اما مطابق با بررسی های صورت گرفته ثبات کمتری نسبت به محلولی که تغییر رنگ نداده، دارد.
توصیه می‌شود محلول نقره آمونیاک پس از آماده سازی درون یخچال قرار گیرد. لازم است این محلول درست قبل از استفاده به دمای اتاق برده شود و بلافاصله بعد از استفاده به یخچال برگردانده شود. اگر نقره آمونیاک را چند روز دریخچال نگهداری کنید، رنگ آمیزی رشتههای رتیکولر بهتر انجام می‌شود. لازم به ذکر است که پس از چند روز محلول شروع به تغییر رنگ به قهوه‌ای و زرد روشن می‌کند که البته ممکن است به تدریج تیره‌تر شود. به احتمال زیاد این تغییر رنگ‌ها تاثیر نامطلوبی بر کیفیت نتایج رنگ‌آمیزی شما نخواهد داشت.
با استفاده از محلول نقره آمونیاک از پیش استفاده شده برای چندین روز، می‌توانید تا حد زیادی میزان مصرف نیترات نقره را کاهش دهید و صرفه‌جویی‌های قابل توجهی در هزینه داشته باشید.
آماده سازی و استفاده از نقره آمونیاک باید با احتیاط بسیار زیادی انجام شود. برای جلوگیری از بروز انفجار، نقره آمونیاک را در یخچال نگهداری کنید زیرا اگر آمونیاک در معرض نور مستقیم خورشید قرار گیرد، احتمال انفجار وجود دارد.
جمع بندی
به طور کلی، تکنیکهای رنگ آمیزی در بافت شناسی کاربرد زیادی دارند و در آزمایشگاه‌ها از آن‌ها استفاده می‌شود. با استفاده از این تکنیک‌ها، آسیب شناسان و محققان قادر هستند تا ساختار بافت را زیر میکروسکوپ مشاهده کنند و با توجه به هدف آزمایش، اطلاعات لازم برای نتیجه گیری را دریافت کنند. در این مطلب ما سعی کردیم تا تکنیک رنگ‌آمیزی را برای رشتههای رتیکولر که در سراسر بدن یافت می‌شوند، شرح دهیم و همچنین نکات و توصیه‌هایی را برای انجام هر چه دقیق‌تر این آزمایش، در اختیار شما قرار دهیم