بررسی اثرN-استیل سیستئین و کادمیوم بر ویژگی‌های هیستوپاتولوژی بافت کبد و بیان برخی از ژن‌های مؤثر در تکثیر سلولی
هدف: اثرات سمیتی مواجهه با کادمیوم عمدتا ناشی از تولید رادیکال‌های آزاد اکسیژن، کاهش آنتی‌اکسیدانت‌های سلولی و بروز استرس اکسیداتیو است که می‌تواند منجر به تخریب اجزای سلولی، آسیب به DNA، آپوپتوزیس و در نهایت آسیب‌های بافتی شود. در این مطالعه به بررسی اثرات محافظتی N-استیل سیستئین، به عنوان یک ماده دارای خواص آنتی‌اکسیدانتی، در موش‌های ویستار مواجهه یافته با کادمیوم از طریق بررسی بافت‌شناسی کبد و سنجش بیان ژن‌های مؤثر در آپوپتوزیس و تکثیر سلولی پرداخته شد. مواد و روش ها: موش‌های با وزن تقریبی 150-200 گرم در سه تیمار شامل، G1) تیمار شاهد، G2) تیمار دریافت‌کننده کادمیوم، و G3) تیمار دریافت‌کننده هم‌زمان کادمیوم و N-استیل سیستئین دسته‌بندی شدند و بهمدت چهار هفته از مواد مورد نظر دریافت کردند. سپس نمونه‌برداری از بافت کبد به‌منظور بررسی هیستوپاتولوژی و بررسی بیان ژن‌های eif4e و mad1 صورت پذیرفت. نتایج: مواجهه با کادمیوم باعث ایجاد آسیب‌های جدی در بافت کبد موش شد که شامل پرخونی رگ مرکزی، افزایش تعداد سلول‌های التهابی و وجود التهاب در پارانشیم کبد بود، درحالی‌که استفاده از N-استیل سیستئین موجب کاهش چشمگیر آسیب‌های مذکور گردید. همچنین، استفاده از N-استیل سیستئین سبب کاهش چشمگیر بیان ژن‌های eif4e و mad1 به میزان 14/2 و 27/2 برابر شد. نتیجه گیری: نتایج این مطالعه پیشنهاد می‌کند که N-استیل سیستئین به‌عنوان یک ماده آنتی‌اکسیدانت می‌تواند نقش مهمی در برابر آسیب‌های بافتی ناشی از استرس اکسیداتیو و جلوگیری از القای آپوپتوزیس سلولی داشته باشد.
• مقدمه
کادمیوم (Cd) یکی از عناصر کمیاب و فلزات سنگین می‌باشد که به‌طور معمول به میزان mg/kg 15/0 در پوسته زمین یافت می‌شود (1). مهم‌ترین کاربرد این فلز سنگین در صنایع تولید باتری است که بیش از 80 درصد مصرف این فلز را در بر می‌گیرد. بهدلیل مصرف روزافزون کادمیوم در صنایع مختلف، میزان این فلز در محیط‌زیست در حال افزایش چشمگیر می‌باشد. بهدلیل ویژگی‌های سمی این فلز، مواجهه با غلظت‌های بیش‌از حد مجاز کادمیوم می‌تواند منجر به آسیب‌های متعدد در بافت‌های مختلف جانوران به‌ویژه در کبد و کلیه شود (1). بهدلیل ناپایداری بالا، این فلز به‌طور عمده در ترکیب با یون‌های معدنی همچون سولفات، کلر، کربنات و همچنین مولکول‌های آلی همچون اسیدهای آمینه، سیترات، سالیسیلیک اسید و هیومیک اسید یافت می‌شود (1-2). اگرچه این عنصر به مقدار ناچیز در آب، هوا و خاک دیده می‌شود، بهدلیل تجمع در پیکره جانداران می‌تواند مخاطرات جدی برای سلامت موجودات زنده ایجاد نماید (3).
مواجهه مستمر با کادمیوم می‌تواند منجر به مخاطرات و مشکلات سلامتی جدی در پستانداران شود که از آن جمله می‌توان به نارسایی کلیه، بیماری‌های عصبی، ناهنجاری‌های اسکلتی، ناباروری و حتی سرطان اشاره نمود (4). به‌عنوان یک یون احیای ناپذیر، مواجهه با کادمیوم می‌تواند منجر به تولید مقادیر فراوان رادیکال‌های آزاد اکسیژن و بروز استرس اکسیداتیو شود (5). در سطح سلولی، مواجهه با کادمیوم می‌تواند منجر به اختلال در بسیاری از فرایندهای سلولی شود که از آن جمله می‌توان به مهار ترمیم و متیلاسیون مولکول‌های DNA، کاهش آنتی‌اکسیدانت‌های سلولی، افزایش فعالیت‌های پروتئازهای سلولی و اختلال در متابولیسم کربوهیدرات‌ها و لیپیدها اشاره نمود. چنین رخدادهایی درنهایت می‌تواند منجر به آسیب‌های جدی و برگشت‌ناپذیر در بافت‌های میزبان شود (6-7). علاوه بر این، بروز موتاسیون، توقف چرخه سلولی و القای آپوپتوزیس از طریق فعالیت پروتئین‌هایی همچون p53 و کاسپازها از پیامدهای رایج مواجهه با کادمیوم در نظر گرفته می‌شود (2، 5).
eif4e یک انکوژن سلولی است که بیان آن به‌طور معمول در بسیاری از سرطان‌ها به‌طور چشمگیری افزایش می‌یابد به‌نحوی‌که برخی از منابع از آن به‌عنوان نشانگر پیش‌آگهی دهنده بروز و توسعه سرطان یاد می‌کنند (8). در سطح مولکولی eif4e به‌عنوان یک فاکتور شروع نویسی منجر به هدایت ریبوزوم به سمت مولکول‌های mRNA می‌شود و از این طریق باعث افزایش ترجمه از رونوشت‌های ژنی می‌شود. مطالعات پیشین نشان داده‌اند که افزایش بیان ژن eif4e منجر به افزایش زنده‌مانی و تکثیر سلول‌ها می‌شود که این امر نقش مهمی در تومور زایی القا می‌نماید. همچنین، این عملکرد در شرایط استرس سلولی افزایش می‌یابد (8).
همچنین پروتئین MAD1 یکی از عوامل تنظیم‌کننده چرخه سلولی از طریق پروتئین p53 است. این پروتئین نقش بسیار مهمی در جداسازی کروماتیدهای خواهری حین تقسیم میتوز و تکثیر صحیح سلولی بر عهده دارد. مطالعات پیشین نشان داده‌اند که بیان ژن mad1 در طول تقسیم میتوز ثابت می‌ماند در حالی‌که افزایش بیان آن می‌تواند منجر به جداسازی غیر صحیح کروماتیدها شده و در نهایت می‌تواند زمینه‌ساز تومور زایی در نظر گرفته شود (9).
N-استیل سیستئین یک ترکیب دارویی بی‌خطر است که به‌عنوان یک عامل آنتی‌اکسیدانت کاربردهای درمانی زیادی دارد. این ماده نه تنها دارای عملکرد آنتی‌اکسیدانتی مستقیم در مقابله با رادیکال‌های اکسیدکننده است، بلکه به‌عنوان پیش ساز گلوتاتیون احیا (GSH) در نظر گرفته می‌شود. با توجه به اینکه مولکول گلوتاتیون به‌عنوان یک ماده آنتی‌اکسیدانت در سلول شناخته می‌شود و این ماده نقش مهمی در مقاومت به استرس اکسیداتیو بر عهده دارد، استفاده از N-استیل سیستئین می‌تواند نقش مهمی در برابر آسیب‌های ناشی از استرس اکسیداتیو داشته باشد (10).
همان‌گونه که ذکر گردید تولید رادیکال‌های آزاد اکسیژن و استرس اکسیداتیو مهم‌ترین عامل بروز سمیت سلولی و آسیب‌های ناشی از مواجهه با کادمیوم است. بنابراین، استفاده از ترکیبات ضد اکسیدان با مهار رادیکال‌های آزاد اکسیژن می‌تواند منجر به کاهش استرس اکسیداتیو در بافت‌های میزبانی شود. بر این اساس، هدف از این مطالعه بررسی بیان ژن‌های mad1 و eif4e و آسیب‌های هیستوپاتولوژیک در بافت کبد موش‌های مواجهه یافته با کادمیوم و همچنین بررسی اثر محافظتیN-استیل سیستئین در آنان می‌باشد.
• مواد و روش‌ها
موش‌های موردمطالعه و گروه‌های آزمایشی: موش‌های نژاد ویستار با سن 8 تا 10 هفته و محدوده وزنی 150 تا 200 گرم از مرکز مطالعات حیوانی انستیتو پاستور ایران خریداری شدند. جانوران مورد مطالعه به مدت یک هفته در شرایط آزمایشگاهی نگهداری شدند و سپس به‌صورت تصادفی در سه گروه آزمایشی و در سه تکرار دسته‌بندی شدند (کد اخلاق: IR.IAU.RASHT.REC.1399.011). جانوران مورد مطالعه در قفس‌های با ابعاد 30×15×15 سانتی‌متر و با تراکم سه عدد در هر قفس نگهداری شدند. گروه‌های آزمایشی مورد مطالعه شامل گروه G1) گروه شاهد، G2) دریافت‌کننده مستمر کادمیوم و G3) دریافت‌کننده مستمر کادمیوم و N-استیل سیستئین بودند. در طول دوران مطالعه، موش‌های گروه G2 به‌صورت مستمر محلول کادمیوم را بهمیزان 5/2 میلی‌گرم/کیلوگرم به صورت یک روز در میان به مدت چهار هفته دریافت نمودند. همچنین، موش‌های گروه G3 به‌صورت مستمر و هم‌زمان از محلول کادمیوم (5/2 میلی‌گرم/کیلوگرم به‌صورت یک روز در میان) و N-استیل سیستئین (50 میلی‌گرم/کیلوگرم) بهمدت 4 هفته دریافت کردند. در گروه شاهد نیز موش‌ها با آب و غذای معمولی تغذیه شدند. تمامی موش‌ها در شرایط یکسان شامل دوره تاریکی و روشنایی 12 ساعته، رطوبت 50 درصد و دمای 22 درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند (10). در این پژوهش کلیه موازین اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی رعایت شده است.
مطالعات بافت‌شناسی: به‌منظور بررسی‌های بافت‌شناسی، 48 ساعت پس از دریافت آخرین دوز، موش‌های مورد مطالعه با استفاده از محلول xylasine (3-5 میلی‌گرم/کیلوگرم) و ketamine (30-50 میلی‌گرم/کیلوگرم) بی‌هوش شدند. به‌منظور مطالعات بافت‌شناسی، بافت کبد خارج شد و در محلول فرمالین 10 درصد تثبیت شد. سپس نمونه‌های کبدی با دستگاه tissue processor آبگیری و آماده‌سازی شد و در پارافین قالب‌گیری شد. درنهایت با استفاده از دستگاه میکروتوم برش‌هایی باضخامت 4-5 میکرومتر تهیه شد و با استفاده از هماتوکسیلین و ائوزین رنگ‌آمیزی شدند. بررسی تغییرات بافتی در موش‌های مورد مطالعه با استفاده از میکروسکوپ نوری انجام پذیرفت.
بررسی بیان ژن: به‌منظور انجام مطالعات بیان ژن، نمونه‌های بافت کبد موش‌های مورد مطالعه توسط دستگاه هوموژنایزر (Hielscher, UP100H) در دمای 4 درجه سانتی‌گراد در بافر نمکی فسفات یکنواخت شد و سپس در دمای 4 درجه سانتی‌گراد بهمدت 15 دقیقه با سرعت 12000 دور در دقیقه سانتریفوژ شدند. مایع بالایی جمع‌آوری شد و تا زمان انجام مطالعات مولکولی در دمای 70- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد (11). استخراج RNA کل از نمونه‌های بافت کبد با استفاده از کیت تجاری استخراج RNA (RNX-Plus (SinaClon; RN7713C) و بر اساس دستورالعمل سازنده انجام پذیرفت. به‌منظور بررسی کمیت و کیفیت RNA استخراج‌شده از دستگاه نانودراپ (Nanodrop ND-1000 Thermo Sci., Newington, NH) و الکتروفورز روی ژل آگاروز 1 درصد استفاده شد. ساختن مولکول DNA مکمل با استفاده از کیت تجاری Revert AidReverse Transcriptase (Thermo Science, Germany) و بر اساس پروتکل شرکت سازنده صورت پذیرفت. بررسی تغییرات بیان ژن‌های mad1 و eif4e در بافت کبد موش‌های تیمارهای مختلف با استفاده از روش real time polymerization chain reaction در دستگاه ترموسایکلر Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Australia) و با استفاده از SYBR Green انجام پذیرفت. حجم نهایی مخلوط واکنش 20 میکرولیتر و حاوی 10 میکرولیتر مستر میکس SYBR Green، یک میکرولیتر از هر پرایمر (2 میکرو مول)، دو میکرولیتر cDNA الگو و شش میکرولیتر آب مقطر بود. فرایند تکثیر قطعات ژنتیکی شامل مرحله واسرشت سازی اولیه (95 درجه سانتی‌گراد/10 دقیقه) و سپس 40 سیکل شامل واسرشتسازی (95 درجه سانتی‌گراد/15 ثانیه)، مکمل سازی (60 درجه سانتی‌گراد/60 ثانیه) و طویل‌سازی (72 درجه سانتی‌گراد/45 ثانیه) انجام پذیرفت. میزان بیان ژن‌های مورد مطالعه با استفاده از روش 2−ΔΔCt محاسبه شد و ژن گلیسرآلدهید فسفات دهیدروژناز (GAPDH) به‌عنوان ژن خانه‌دار به‌منظور نرمال‌سازی داده‌ها مورد استفاده قرار گرفت (2). توالی پرایمرهای مورد استفاده در این مطالعه در جدول 1 نمایش داده شده است.
پرایمرهای مورد استفاده در این تحقیق
رفرنس توالی اسم ژنها
12 5’-CTGCGGCTGATCTCCAA-G-3’
5’-CTGCGGCTGATCTCCAAG-3’ eif4e-Forward
eif4e-Reverse
13 5’ -CTGCGTGAGAAAGAGGACAGTCT-3’
5’-GAGATCCTCCCCTTCAGT-3’ mad1- Forward
mad1- Reverse
12 5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTT-3’
5’-CCTGGAAGATGGTGATGGGATT-3’ GAPDH- Forward
GAPDH- Reverse
آنالیز آماری
به منظور بررسی احتمال وجود تفاوت معنی‌دار در نمونه‌های موردمطالعه از نرم‌افزار SPSS نسخه 19 و آزمون آماری آنالیز واریانس یک‌طرفه استفاده شد و مقدار 05/0>p به‌عنوان سطح معنی‌داری در نظر گرفته شد
نتایج
بررسی تغییرات هیستوپاتولوژی در بافت کبد
مطالعات بافت‌شناسی بر روی بافت کبد موش‌های تیمارهای مختلف نشانگر وجود آسیب‌های بافتی شدید در بافت کبد موش‌های دریافت‌کننده محلول کادمیوم می‌باشد. شدیدترین آسیب‌های بافتی مرتبط با موش‌های تیمار G2 بود. مهم‌ترین آسیب‌های بافتی مشاهده شده شامل پرخونی رگ مرکزی، افزایش تعداد سلول‌های التهابی و وجود التهاب در پارانشیم کبد بود. بررسی بافت کبد موش‌های متعلق به گروه G3 که هم‌زمان با کادمیوم، ان-استیل سیستئین دریافت نمودند نشان‌دهنده وجود آسیب‌های بافتی بسیار خفیف‌تر در مقایسه با تیمار G2 بود. ضمن اینکه تغییرات بافتی چندانی در بافت کبد موش‌های تیمار شاهد مشاهده نشد.
ویژگی‌های هیستوپاتولوژیک بافت کبد موش‌های کنترل (G1)، دریافت‌کننده کادمیوم (G2) و دریافت‌کننده هم‌زمان کادمیوم و N-استیل سیستئین(G3). فلش ها پرخونی و سلول‌های التهابی را نشان میدهند (بزرگنمایی 40x).
تغییرات بیان ژن‌های mad1 و eif4e در سلول‌های بافت کبد
تغییرات بیان ژن‌های mad1 و eif4e، به‌عنوان ژن‌های دخیل در فرایند تکثیر سلولی و آپوپتوزیس در موش‌های تیمارهای مختلف مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج نشان داد که در موش‌های دریافت‌کننده کادمیوم میزان بیان ژن eif4e به‌طور متوسط بهمیزان 55/4 برابر بیشتر از تیمار شاهد بود در حالی‌که در موش‌هایی که به‌طور هم‌زمان کادمیوم و N-استیل سیستئین دریافت نمودند میزان بیان ژن مذکور 40/2 برابر بیشتر از تیمار شاهد بود. علاوه بر این، میزان بیان ژن mad1 در موش‌های تیمار دریافت‌کننده کادمیوم 47/4 برابر بالاتر از موش‌های شاهد بود در حالی‌که در موش‌های دریافت‌کننده هم‌زمان کادمیوم و N-استیل سیستئین بیان نسبی ژن mad1 به میزان 19/2 برابر بیشتر از تیمار شاهد بود. به‌بیان‌دیگر، موش‌های دریافت‌کننده هم‌زمان کادمیوم و N-استیل سیستئین میزان افزایش بیان کمتری را در مقایسه با موش‌های دریافت‌کننده کادمیوم نشان دادند. تغییرات بیان ژن در موش‌های تیمارهای مختلف در شکلهای 2 و 3 نمایش داده شده است.
در این مطالعه به بررسی اثر محافظتی N-استیل سیستئین در برابر مواجهه با کادمیوم از طریق بررسی هیستوپاتولوژی و بیان ژن‌های دخیل در تکثیر سلولی و آپوپتوزیس در بافت کبد موش‌های مواجهه یافته با کادمیوم و تیمار شده با N-استیل سیستئین پرداخته شد. گزارش‌های متعددی در مورد اثرات سمی مواجهه با کادمیوم در اندام‌های مختلف پستانداران وجود دارد. اغلب این مطالعات به نقش کادمیوم در کاهش میزان آنتی‌اکسیدانت‌های بافتی و بروز استرس اکسیداتیو به‌عنوان عامل اصلی سمیت کادمیوم اشاره نمودند. در مطالعه‌ای که در سال 2015 توسط Manoharan و همکاران (14) بر موش‌های مواجهه یافته با کادمیوم انجام یافت نشان داده شده که کادمیوم می‌تواند منجر به بروز آسیب‌های اکسیداتیو در بافت قلب ماهیان گردد. آنان همچنین نشان دادند که استفاده از پروآنتوسیانیدین‌ها، به‌عنوان آنتی‌اکسیدانت‌های طبیعی، به طرز چشمگیری منجر به کاهش آسیب‌های ناشی از کادمیوم می‌شود. در مطالعه‌ای دیگر مشاهده شد که یکبار مواجهه با کادمیوم بهمیزان 15 و 30 میلی‌گرم/کیلوگرم منجر به افزایش چشمگیر نشانگرهای زیستی استرس اکسیداتیو ازجمله مالون دی آلدهید و پروتئین‌های اکسیدشده شد (15). بر این اساس آسیب‌های وارده به بافت کبد در موش‌های دریافت‌کننده کادمیوم را می‌توان به تولید بیش از اندازه رادیکال‌های آزاد اکسیژن و آسیب‌های ناشی از استرس اکسیداتیو مرتبط دانست. از این منظر نتایج این مطالعه با نتایج پیشین منطبق می‌باشد.
با توجه به نقش رادیکال‌های آزاد اکسیژن در بروز آسیب‌های بافتی و همچنین وجود گزارش‌های متعدد در مورد القای استرس اکسیداتیو در اثر مواجهه با کادمیوم، در این مطالعه به بررسی نقش محافظتی N-استیل سیستئین، به‌عنوان یک ماده دارای عملکرد آنتی‌اکسیدانتی، در برابر مواجهه با کادمیوم در مدل موشی پرداخته شد. نتایج نشان داد که N-استیل سیستئین به‌طور قابل‌توجهی منجر به کاهش آسیب‌های بافتی در کبد موش‌های دریافت‌کننده کادمیوم شد. همسو با نتایج این مطالعه، مطالعات متعددی نشان دادند که استفاده از N-استیل سیستئین می‌تواند منجر به ایجاد مقاومت در برابر آسیب‌های بافتی ناشی از استرس اکسیداتیو و همچنین التهابات بافتی شود (16-17). با توجه به نقش N-استیل سیستئین در بیوسنتز گلوتاتیون احیاء، به عنوان مهم‌ترین آنتی‌اکسیدانت سلولی، می‌توان نتیجه گرفت که دریافت خوراکی N-استیل سیستئین با تأمین گلوتاتیون سلولی منجر به حفظ توازن اکسیداتیو در موش‌های مورد مطالعه و در نتیجه کاهش آسیب‌های کبدی ناشی از کادمیوم شده است. همچنین اثر ضدالتهابی N-استیل سیستئین در برابر آسیب‌های اکسیداتیو در بافت کبد گزارش شده است که با توجه به مشاهده کاهش نشانگرهای التهابی در کبد موش‌های موردمطالعه، نتایج این مطالعه منطبق با نتایج پیشین است (18).
علاوه بر این، گزارش شده است که N-استیل سیستئین می‌تواند منجر به تغییر میزان بیان ژن‌های دخیل در چرخه سلولی و مسیر آپوپتوزیس شود (2، 8-9). گزارش‌های متعددی در مورد نقش eif4e، به‌عنوان یک انکوژن سلولی در بروز سرطان وجود دارد. بر اساس این مطالعات، افزایش بیان ژن eif4e نقش مهمی در افزایش زنده‌مانی و تکثیر سلول‌ها بر عهده داشته و می‌تواند منجر به فعال‌سازی فرایند ایجاد سرطان در بافت‌های مختلف شود. همچنین، بیان این ژن در شرایط استرس اکسیداتیو افزایش می‌یابد (2، 8). در این مطالعه مشاهده شد که مواجهه با کادمیوم می‌تواند منجر به افزایش بیان ژن مذکور در موش‌های موردمطالعه به میزان 5/4 برابر در مقایسه با موش‌های شاهد شود. بنابراین افزایش بیان ژن eif4e در اثر مواجهه با کادمیوم منطبق با نتایج سایر محققین است. همچنین، مشاهده گردید که درمان با N-استیل سیستئین، منجر به کاهش بیان ژن مذکور به میزان 14/2 برابر در مقایسه با موش‌های دریافت‌کننده کادمیوم شد. بر این اساس می‌توان نتیجه گرفت که N-استیل سیستئین می‌تواند نقش مهمی را در برابر فعال‌سازی انکوژن eif4e و بروز سرطان ناشی از آن داشته باشد. علاوه بر این، مشاهده شد که درمان با N-استیل-سیستئین منجر به کاهش بیان ژن mad1 بهمیزان 27/2 برابر شد. با توجه به اینکه افزایش بیان ژن مذکور می‌تواند با ایجاد اختلال در تقسیم کروماتیدهای سلولی و تکثیر سلولی سبب ایجاد جهش ژنتیکی و بروز سرطان شود، کاهش بیان این ژن در موش‌های دریافت‌کننده N-استیل سیستئین نشانگر نقش پیشگیرانه این دارو در برابر تومور زایی از طریق تنظیم بیان ژن‌های دخیل در چرخه سلولی شود (2، 9).
• نتیجه¬گیری
نتایج این مطالعات نشان داد که استفاده از N-استیل سیستئین به‌عنوان یک ماده آنتی‌اکسیدانت می‌تواند منجر به کاهش آسیب‌های بافتی اکسیداتیو در بافت کبد موش‌های مواجهه یافته با کادمیوم شود. همچنین، استفاده از این ماده با تنظیم بیان ژن‌های مؤثر در چرخه سلولی می‌تواند از دگرگونی و بروز سلول‌های سرطانی جلوگیری نماید. نتایج این مطالعه پیشنهاد می‌کند که N-استیل سیستئین به‌عنوان یک ماده آنتی‌اکسیدانت می‌تواند نقش مهمی در برابر آسیب‌های ناشی از استرس اکسیداتیو و بازیابی عملکردهای طبیعی بافتی داشته باشد.
