استفاده از آزمایشات مولکولی در تشخیص انواع بیماری‌های عفونی

انجام آزمایشات تشخیصی پی‌سی‌آر

طی انجام آزمایشات، تکثیر DNA به صورت لگاریتمی انجام می‌شود. و از DNA تکثیر شده به عنوان الگوی اصلی در همانندسازی استفاده می‌شود. در تمام مراحل انجام PCR از آنزیم taq مقاوم به حرارت استفاده می‌شود. در مرحله اول این آزمایش دو رشته DNA در دمای بالای و طی فرآیند ذوب به دو رشته مجزا تبدیل می‌شوند. در این حالت می‌توان به آسانی دو رشته از هم جدا می‌شوند.

اجزای مورد نیاز برای آزمایش PCR

• DNA دو رشته‌ای
• آنزیم taq
• پرایمر
• دزوکسی نوکلئوتیدهای سه فسفاته
• محلول بافر
• منیزیم کلرید

روش انجام PCR

واکنش‌های PCR معمولا در حجم‌های بین 10 تا 200 میکرولیتر انجام می‌شود. چرخه دمایی در آن حدود 20 تا 40 مرتبه تکرار می‌شود. که هر یک از سیکل‌های دمایی دارای دو تا سه مرحله دمایی مجزا هستند. در اولین مرحله DNA تحت دمای 98 درجه سانتیگراد قرار می‌گیرد. این مرحله که حدود 1 تا 10 دقیقه طول می‌کشد، برای فعال‌سازی آنزیم‌ها است. در مرحله بعد که بین 20 تا 30 دقیقه زمان نیاز دارد در دمای 94 درجه سانتیگراد دو رشته DNA از هم جدا می‌شوند. در مرحله بعد در دمای 50 تا 65 درجه سانتیگراد و به مدت 20 تا 40 ثانیه اتصال دو رشته DNA انجام می‌شود. مرحله نهایی یا همان طویل شدن DNA نیز در محدوده دمایی 75-80 درجه سانتیگراد و در جهت 5 به 3 انجام می‌شود.

مسترمیکس

مسترمیکس به محققین اجازه می‌دهد نظارت و کنترل بیشتری بر روند انجام آزمایشات داشته باشند. با استفاده مسترمیکس نیاز به افزودن جداگانه کوفاکتور، آنزیم، بافر، و آب به هر لوله آزمایش وجود ندارد. با استفاده از این روش، مخلوط حاوی پی‌سی‌آر یک مرتبه تولید می‌شود. سپس میزان کافی از این محلول در لوله‌های آزمایش مختلف ریخته می‌شود.

کاربرد مسترمیکس PCR

می‌توان از این ابزار برای انجام پی‌سی‌آرهای معمولی، PCR مالتی پلکس، کاهش تعداد دایمرهای پرایمر و تنظیم دما استفاده کرد.

محتویات مسترمیکس

• آنزیم
• بافر
• کوفاکتور که غالبا کلرید منیزیم و گاهی سولفات منیزیم است.
• dNTP
• آغازگر
• الگوی DNA
• آب

مزایا استفاده از مسترمیکس

• سهولت و راحتی انجام کار
• آماده بودن مواد
• کاهش زمان تولید محیط واکنش
• انسجام بالا
• کاهش خطای آماده‌سازی

کیت ریل تایم پی‌سی‌آر

این روش تکنیکی برای نظارت بر انجام پی‌سی‌آر در زمان واقعی است. در ریل تایم PCR ، مقدار کوچکی از پی‌سی‌آر را از نظر DNA و RNA از نظر کمی بررسی می‌شود. ریل تایم PCR بر اساس تشخیص ماده فلورسنت ناشی از مولکول گزارشگر انجام می‌شود. تولید ماده فلورسنت با ادامه مسیر آزمایش افزایش می‌یابد. در ریل تایم PCR می‌توان با حداقل میزان اسید نوکلئیک، دقیق‌ترین جواب را به دست آورد. علاوه بر این، با استفاده از این روش به دلیل عدم نیاز به پردازش پی‌سی‌آر می‌تواند در هزینه نهایی صرفه‌جویی کرد. در ریل تایم PCR یک چرخه اضافی با نام رونویسی معکوس وجود دارد. که در این چرخه از روی RNA اقدام به تولید DNA می‌نماید. دلیل این امر هم پایداری بیشتر مولکول DNA در مقایسه با رشته RNA است.

کاربردهای کیت پی‌سی‌آر ریل تایم

• مطالعات کمی مرتبط با بیان RNA
• اندازه گیری تعداد نسخه‌های کپی DNA موجود در ژنوم
• انجام آزمایش‌های تشخیص آللی
• تایید نتیجه میکرواری
• کمک به درمان دارویی موثرتر
• تعیین میزان آسیب به DNA

انواع کیت‌های تشخیص، آزمایشگاهی و تحقیقاتی

کیت‌های تشخیصی یک‌سری کیت‌های خاص هستند که از طرف کمپانی‌های معین برای انجام آزمایشات و تحقیقات تولید و عرضه می‌شوند. کیت‌های حاوی شاخص کار تحقیقاتی و آزمایشاتی هستند. استفاده از کیت‌های تشخیصی این فرصت را ایجاد می‌کند که که با حضور نمونه توانایی شناسایی فاکتور هدف را داشته باشیم. دو دسته مختلف از کیت‌ها وجود دارد: کیت تحقیقاتی و کیت تشخیصی. کیت‌های تشخیصی در آزمایشات مختلف بالینی و آسیب‌شناسی مورد استفاده قرار می‌گیرند. اما کیت‌های تحقیقات در انجام پژوهش در حیطه پزشکی، آسیب‌شناسی و … کاربرد دارند.

مهمترین کیت‌های تحقیقاتی عبارتند از کیت‌های سلولی، مولکولی، ژنتیکی، تست‌های الایزا، PCR، و کیت  استخراج. در ادامه به معرفی مهمترین کیت‌های تحقیقاتی خواهیم پرداخت:

کیت استخراج

از کیت استخراج معمولا برای جداسازی DNA-RNA و یا پلازیمد و پروتئین‌های سلولی استفاده می‌شود. نمونه هایی که می‌تواند در کیت استخراج استفاده شود شامل خون، بافت تازه و منجمد شده، عصاره، سرم، انواع باکتری‌ها و قارچ‌ها هستند. پس از خالص‌سازی ماده استخراج شده می‌توان از آن در سایر مصارف مورد نیاز در پزشکی استفاده کرد. کیت‌های استخراج دارای فرمولاسیون خاص هستند. و محتویات آنها با توجه به شرکت سازنده آنها متفاوت خواهد بود. دارای اندازه 50،100 و 250 می‌باشند که انتخاب اندازه باید با توجه به آزمایش و واکنش مورد نظر انتخاب شود.

کیت پی‌سی‌آر

یکی از پرکاربردترین کیت‌های تحقیقاتی در حوزه زیست شناسی کیت پی‌سی‌آر است. در حقیقت پی‌سی‌آر به معنی مجموعه ای از واکنش‌های زنجیره‌ای پلیمرازی است. که با استفاده از این کیت‌ها، یک نسخه از ماده ژنتیکی با تعداد بالا تکثیر می‌شود. اساس اصلی کار در این روش تغییر دما است. مواد مختلفی در این کیت پی‌سی‌آر استفاده می‌شود. مواد موجود در کیت‌های پی‌سی‌آر عبارت است از بافر، نوکلئوتیدهای آزاد، کلرید منیزیم، انواع پرایمرها، آنزیم و آب مقطر. در این روش با استفاده از دستگاه ترموسایکلر و از طریق تغییر دما زنجیره‌ها از هم باز می‌شوند و آنزیم‌های آنها فعال می‌شود. در انتهای کار نیز با تغییر دمای مجدد، اتصال زنجیره‌ها انجام می‌شود.

کیت‌های تشخیص مولکولی

کیت تشخیص ایدز (HIV)

برای تشخیص بیماری ایدز نیز از کیت‌های آزمایشگاهی استفاده می‌شود. خطرناک‌ترین ویروس دنیای امروز که فاقد درمانی قطعی است، ایدز می‌باشد. درمان دارویی قطعی برای این بیماری وجود ندارد. در نتیجه بهترین راه درمان برای این بیماری پیشگیری است. افزایش آمار اعتیاد و روابط جنسی خارج از چارچوب سبب شده سیر ابتلا به ایدز در ایران و جهان صعودی باشد. اگر فردی برای مدت زمان طولانی تب، کاهش وزن و ابتلا به بیماری‌های عفونی را داشته باشد، در صورت استفاده از سرنگ مشترک یا رابطه جنسی خارج از عرف ، اولین آزمایشی که حتما انجام خواهد شد، تست ایدز است. از کیت تشخیص ایدز برای بررسی میزان آنتی‌بادی موجود در خون استفاده می‌شود. علاوه بر اینکه می‌توان تست ایدز را در مراکز و آزمایشگاه‌های معتبر انجام کیت تشخیص ایدز در داروخانه‌ها نیز وجود دارد که با تهیه آن می‌توانید از مثبت یا منفی بودن ابتلای خود به ایدز مطلع شوید.

کیت تشخیص HPV

ویروس پاپیلومای انسان عمده‌ترین دلیل ابتلا به سرطان دهانه رحم است. این بیماری از طریق انواع مختلف روابط جنسی منتقل می‌شود. در نتیجه انتقال دهانی نیز دارد. عدم درمان این بیماری می‌تواند زمینه ساز سرطان حلق و حنجره باشد. حدود 100 نوع عامل برای این بیماری شناخته شده است. با توجه به عامل ایجاد بیماری و محدوده سنی درمان متفاوت است. ابتلا در سنین کمتر از بیست سال به دلیل قوای جنسی بالا حتی بدون درمان طی دو سال برطرف می‌شود. عواملی ماند تعداد زیاد  شرکای جنسی، برقراری رابطه جنسی در سنین پایین، رابطه جنسی افسار گسیخته و عدم رعایت نکات بهداشتی می‌تواند احتمال ابتلا به این بیماری را افزایش دهد. معمولا در افراد بالای 31 سال حتما باید آزمایش‌های تشخیصی برای بررسی احتمال ابتلای افراد به این بیماری انجام شود.

کیت‌های مولکولی هپاتیت بی (HBV) ، هپاتیت سی (HCV)، کرونا ویروس

یکی از مهمترین بیماری‌های ویروسی دارای درصد بالای ابتلا در جهان، هپاتیت بی (HBV) است. از روش‌های مولکولی مختلف برای شناسایی ابتلا به این بیماری ویروسی استفاده می‌شود. پی‌سی‌آر، تکثیر هم دما، دورگه‌سازی، هیبریداسیون می‌توانند در مراحل اولیه آلودگی به این ویروس موفق عمل کنند. برای تعیین این بیماری باید اول نمونه از DNA استخراج شود. سپس با استفاده از پی‌سی‌آر و پرایمر نسبت به شناسایی این ویروس اقدام می‌کنند.

شناسایی هپاتیت سی بر اساس تعیین میزان آنتی بادی HCV به وسیله آزمایش الایزا و تعیین میزان RNA-HCV به روش پی‌سی‌آر ریل تایم است. تنها میزبان هپاتیت سی انسان است. این ویروس از یک RNA انولوپ دار تشکیل شده است. این ویروس از خانواده فلاوی ویریده است که دارای 6 ژنوتیپ و 4 ساب تیپ است. روش‌های مختلفی برای شناسایی هپاتیت سی انجام می‌شود که عبارت است از:

• تشخیص سرولوژیکی هپاتیت سی: با استفاده از نسل سوم آنزیم‌های ایمونواسی می‌توان تعداد آنتی‌بادی‌های ضد ویروس هپاتیت سی را در سرم یا پلاسما تعیین کرد. البته از این آزمایش نمی‌توان برا تعیین ژنوتیپ ویروس هپاتیت سی استفاده کرد.
• تعیین RNA ویروس: RNA را می‌توان به روش کمی و کیفی می‌توان تعیین کرد. برای تعیین تعداد کمی RNA می توان از روش PCR استفاده کرد. برای تعیین ژنوتیپ هپاتیت سی نیز می‌توان از کیت های تجاری استفاده کرد.
• تشخیص هپاتیت سی حاد: برای تعیین ابتلای افراد به هپاتیت سی حاد باید از هر دو روش ایمونواسی و تعیین RNA ویروس انجام خواهد شد. در این آزمایش اگر میزان RNA ویروس مثبت اما تعداد آنتی بادی منفی باشد، نشانه ابتلا به هپاتیت حاد است. اما اگر در یک آزمایش هم میزان آنتی بادی و هم RNA ویروس مثبت باشد، این مورد نشان دهنده ابتلا به هپاتیت سی مزمن است. اما اگر میزان RNA ویروس منفی و تعداد آنتی‌بادی‌ها مثبت باشد به هیچ عنوان احتمال ابتلا به هپاتیت سی حاد وجود ندارد.

تست مولکولی کرونا ویروس

برای کرونا ویروس دو نوع تست PCR و آنتی بادی به کار می‌رود. در تست پی‌سی‌آر برای کرونا یک سواب پنبه‌ای 15 سانتی‌متری را در بینی فرو می‌کنند. حدود 15 ثانیه باید این سواب در محیط داخل بینی گردانده شود. این حرکت فاقد درد است اما می‌تواند سبب ناراحتی فرد شود. سپس برای انجام آزمایشات پی‌سی‌آر این سواب به آزمایشگاه‌های تشخیصی فرستاده می‌شود. علاوه بر این می‌توان از حلق و حفره دهان، وسط و جلوی فره بینی نیز نمونه‌برداری کرد. اگر فرد سرفه‌های پروداکتیو یا خلط دار داشته باشد پزشک برای تشخیص قطعی از خلط سرفه او نیز نمونه‌برداری خواهد کرد.

در انجام آزمایش آنتی‌بادی برای کووید19 دو نوع آنتی‌بادی IgM و IgG شناسایی شده است. میزان تولید  IgM  بعد از دو هفته در بدن کاهش می‌یابد اما تولید IgG  آهسته‌تر از آنتی بادی اول انجام می‌شود. در نتیجه دوام بیشتر و در حدود 4 هفته خواهد داشت. با استفاده از سوآب تنها می‌توان وجود ویروس کرونا را در بدن تشخیص داد. اما انجام آزمایش خون می‌تواند به طور دقیق تعیین کند که شما به این بیماری مبتلا هستید یا خیر.