سرطان خون چیست؟

سرطان خون حدود هشت درصد کل سرطان ها را تشکیل می دهد. شناخت اپیدمیولوژی و روند سرطان خون جهت برنامه ریزی ضروری می باشد. لوسمی (سرطان خون) میلوئیدی مزمن یک بیماری کلونال بدخیم سلولهای پایه خونساز است
که نتیجه آن افزایش سلولهای میلوئیدی، اریتروئیدی و پالکتها در خون محیطی و هیپرپلازی در مغز استخوان است.
سیتوکراتین 19 بخشی از اسکلت سلولی در سلول های اپی تلیالی و کوچکترین عضو از خانواده سیتوکراتین ها می باشد. CK19 به عنوان مارکر سلول های اپی تلیالی شناخته شده است. سیتوکراتین19 (CK19)کوچکترین عضو از خانواده سیتوکراتین ها می باشد. در مطالعه حاضر بیان نسبی ژن CK19 در بیماران مبتلا به CML تازه تشخیص داده شده و ارتباط آن با ویژگی های بالینی آنها را بررسی گردید. 50 بیمار مبتلا به سرطان خون نوع CML با50فرد سالم مقایسه شدند. پس از گرفتن خون و استخراج Total RNA ، cDNA ساخته شد و سپس با روش Real-time RT-PCR بررسی و نتایج حاصل بررسی گردید. بیان ژن CK19 در سلول های لوسمی در مقایسه با نمونه های کنترل به وسیله PCR-RT time Real مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج حاصل نشان دادبیان ژن CK19 افزایش بیان معنی داری در گروه بیمار ندارد. بررسی حضور بیومارکر سیتوکراتین 19در مراحل اولیه بیماری می تواند به عنوان شاخص پیش آگهی مناسبی در خون بیماران مطرح گردد.

سرطان خون یا لوسمی یا لوکمیا بیماری پیشرونده و بدخیم اعضای خون ساز بدن است .

این بیماری در اثر تکثیر و تکامل ناقص گویچههای سفیدخون و پیش سازهای آن در خون و مغز استخوان ایجاد میشود لوسمی یکی از چهار سرطان شایع در میان کودکان است. در بیماری لوکمی یا همان سرطان خون، مغز استخوان به صورت
غیرعادی، مقدار بسیار زیادی سلول خونی تولید میکند.

این سلول ها با سلول های خون نرمال و عادی متفاوت هستند و درست عمل نمیکنند. در نتیجه، تولید سلولهای سفید خون طبیعی را متوقف کرده و توانایی فرد را در مقابله با بیماریها از بین میبرند. لوسمی بر اساس نوع گویچه سفید خون که دچار تراریختگی (ترانسژن) و سرطان شده به دو دسته تقسیم میشود:

لنفوئیدی یا لنفوبلا ستی:

این نوع لوسمی سلولهای لنفاوی یا لنفوسیتها را تحت تأثیر قرار میدهد که بافتهای لنفاوی رامیسازند. این بافت جزء اصلی سیستم ایمنی بدن است و در قسمتهای مختلف بدن از جمله غدد لنفاوی، طحال یا لوزهها یافت میشود.

میلوئیدی یا مغز استخوانی:

این نوع لوسمی سلولهای مغز استخوانی را تحت تأثیر قرار میدهند. سلولهای مغز استخوان شامل سلولهایی است که بعداً به گلبولهای قرمز، گلبولهای سفید و سلولهای پلاکت ساز تبدیل میشوند.

همچنین هر دو دسته لوسمی به دو نوع حاد و مزمن تقسیم میشوند لذا چهار نوع کلی لوسمی داریم:

(لوسمی حاد میلوئیدی )AML
(لوسمی مزمن لنفوئیدی)CLL
(لوسمی حاد لنفوئیدی) ALL ،
(میلوئیدی لوسمی مزمن میلوئیدی) که به اختصار CML گفته میشود.

سلول های مغز استخوان را تحت تاثیر قرار می دهد که بافت های مغز استخوان را می سازند و روندی مزمن دارد. این بیماری اغلب افراد بزرگسال را درگیر میکند، اگرچه میتواند در هر سنی رخ دهد .وقـوع ایـن بیماری سالانه 1تا 3 نفر در هر 100000 نفـر اسـت و احتمالا بیشترین مطالعات روی بدخیمی های انسان روی این بیمـاری صورت گرفته است .CML توسط کرومـوزوم فیالدلفیـا شناخته می شود که در واقع یک ناهنجاری اکتسابی کلونـال بـوده و از جابـجـایی کرومـوزوم هـای 9 و 22 و تشـکیل انکوژن اتصالی ABL-BCR ایجاد مـیگـردد. در دهـه هـای اخیر تشخیص CML راحت تر شده که علت درک عمیق تـر پاتوژنز مولکولی و تعیین هدفدار داروها به منظور عملکرد مناسب در محل مورد نظر میباشد .شواهدی مبنی بر اینکه عوامل شیمیایی برای ایجاد لوکمی به عنوان عوامل ایجاد CML شناخته شده باشند،وجود ندارد و نیز گزارش شده است که ارثی بودن CML در مقایسه با CLL بسیار ضعیف است . لوسمی میلوئیدی مزمن به دلیل تکثیر بیش از حد سلول های رده میلوسیت در مغز استخوان ایجاد میشود و در نتیجه همیشه در کسانی که دچار این بیماری هستند، سلول های بازوفیل، فیلوسیت، متافیلوست و نوتروفیل در خون بالاتر از حد نرمال وجود دارد. سرطان خون یکی از مهمترین انواع سرطان در دنیاست. از سوی دیگر معمولا تشخیص بیماری در مراحل اولیه آن از اهمیت قابل ملاحظه ای برخوردار است و تاخیر در تشخیص زود هنگام این دسته از بیماریها به میزان قابل توجهی اثر اقدامات درمانی را کاهش میدهد.
یکی از روش های رایجی که برای تشخیص سرطان به کار گرفته میشود، روش های آزمایشگاهی است که معمولا با
استفاده از بیومارکرها صورت میگیرد. پیدا کردن عامل مولکولی که بتواند سبب تشخیص این بیماری در سلولهای
خونی در مراحل اولیه  است میتواند کمک فراوانی برای اقدامات پیشگیرانه در این زمینه داشته باشد.

هدف این مطالعه نیز بررسی ارتباط میزان کمی بیان بیو مارکر 19-CK با سرطان خون در مراحل اولیه و کشف راهکار مناسب برای تشخیص زودهنگام سرطان خون در مراحل اولیه با نمونه گیری از خون و حداقل تهاجم به بیمار با کمترین هزینه میباشد. در این مطالعه پتانسیل بیان ژن 19-CKبه عنوان بیومارکری مولکولی در تشخیص سرطان خون با روشی غیرتهاجمی در سیستم گردش خون با استفاده از تکنیکPCR Time Real مورد بررسی قرار گرفت تا بتوان با انجام تحقیق و بررسی بیشتر در مورد مکانیسم و نحوه اثر این ژن از آن به عنوان یک هدف مناسب برای درمان سرطان خون استفاده کرد.

مواد و روشها:

نمونه گیری بیماران مطالعه شده در این پژوهش، شامل بیماران مبتلا به لوسمی میلوبلاستیک مزمن مراجعه کننده به بیمارستان و در مجموع 50 بیمار بودند. معیارهای ورود به مطالعه افراد گروه بیماران شامل افرادی شد که فاقد سابقه
عفونت های حاد ویروسی، بیماریهای خودایمنی، اختالالت غدد درون ریز، ناهنجاریهای کروموزومی بودند.
این بیماران قبل از شروع شیمی درمانی مورد نمونه برداری  قرار گرفتند. سپس نمونه گیری از خون وریدی انجام گرفت.
در ضمن خون 50 فرد شاهد به عنوان گروه کنترل، مانند نمونه بیمار گرفته شد.

استخراج RNA از نمونه جمع آوری شده با به کارگیری کیت استخراج miRNA شرکت MN آلمان انجام شد. استخراج RNA با استفاده از محتویات درون کیت انجام شد. RNA نمونه ی در20C –یا در80C° –ذخیره سازی شد. سپس جهت سنجش کمیت RNA استخراج شده رقت 1/50 از RNA تهیه و با دستگاه اسپکتروفوتومتر غلظت و نسبت 260/280 اندازه گیری شد.
به منظور سنتز cDNA از RNA استخراج شده از محصول QuantiTect Reverse Transcription کیت شرکت کیاژن استفاده گردید الزم به ذکر است که کلیه مراحل روی یخ انجام شد.

طراحی پرایمر و پروب و بررسی کیفیت آنها پرایمرها و پروب های اختصاصی برای ژن های مورد نظر به منظور بررسی بیان در سطح RNA در نرم افزار Version (3.05) Gene runner طراحی شد.  در طراحی پروب های Taqman از خاموش کننده TAMRA)Quencher )در انتهای ʹ3 و از گزارشگر FAM در انتهای ʹ5 استفاده شده است. با BLAST NCBI اختصاصیت پرایمرها برای چسبیدن به ژنوم انسانی مورد بررسی قرار گرفت تا از منحصر به فرد بودن محل جفت شدن پرایمرها اطمینان حاصل شود. نتایج جستجو در ژنوم انسان، نشان داد که کلیه پرایمرها محل اتصال منحصر به فردی را دارا هستند.

جهت یافتن غلظت بهینه پرایمر ابتدا برای هر یک از آنها واکنش PCR Time-Real با استفاده از7.5 میکرولیتر ,میکرومولار0.2 ،0.3 ،0.4 ،0.5پرایمر غلظت با و Design در حجم کلی 15 میکرولیتر انجام شد. غلظتی که در آن کمترین سیکل آستانهCt (و بیشترین میزان فلورسانت )(rn∆) مشاهده شد به عنوان بهترین غلظت پرایمر مورد استفاده قرار گرفت. این روش فقط برای تخمین کیفیت پرایمرها مورد استفاده قرار گرفت و نتایج با روش man/Taq مورد بررسی قرار گرفت.

چرخه های دمایی به صورت10دقیقه 95و40 درجه سانتیگراد چرخه°C 95 به مدت 15 ثانیه و °C 60 به مدت 30 ثانیه بود. اندازهگیری میزان فلورسانت توسط دستگاه Biosystems Eco و آنالیز اولیه دادهها توسط نرمافزار 0.5.ver system software انجام شد.
در انتهای ʹ5 و خاموش FAM پروب ها با استفاده از گزارشگر در انتهای ʹ3 نشاندار شده اند.