رنگ آمیزی اسپور باکتری

برخی از باکتری ها قادر به ایجاد اسپور هستند. اسپور یا آندواسپور مرحله استراحت و نیز مرحله مقاوم در باکتری ها است. اسپورها می توانند در شرایط نامساعد که باکتری ها قادر به تحمل آن نیستند، مانند: حرارت، سرما، خشکی، مواد شیمیایی، تشعشعات و … زنده بمانند هر باکتری فقط یک اسپور می سازد و از هر اسپور یک باکتری بوجود می آید. اسپور ها به شکل درون سلولی توسط برخی از باسیل ها تولید می شوند به همین دلیل به آنها آندوسپور می گویند

اندازه و محل قرار گرفتن اسپور در داخل باکتری نیز برای تشخیص ارگانیسم ها اهمیت دارد مثلا اسپور ها می توانند در مرکز ، نزدیک به انتها و یا در انتهای یاخته قرار بگیرد. اسپور ممکن است کروی یا بیضی باشد اندازه آن بین 2 تا 4 میکرون است. در برخی از موارد قطر اسپور از قطر باکتری بزرگ تر است و باعث ایجاد برجستگی در شکل باکتری می شود گاهی نیز اسپور هم اندازه یا کوچکتر از باکتری است.

اسپور  بخشی ازچرخه زندگی بعضی از جنس های باکتری ها می باشد و در واقع اسپور یک مرحله خفته یا غیر فعال از زندگی باکتری است . اسپورزایی  در باکتری ها بر خلاف آنچه در بعضی گیاهان عالی دیده می شود ، نوعی تکثیر تولید مثلی نیست. زیرا هر باکتری فقط یک اسپور  تولید می کند و هر اسپور  به نوبه خود به یک سلول رویشی (باکتری فعال) تبدیل می شود. بنابراین در گونه های مولد اسپور مانند سایر گونه های باکتریایی تکثیر از طریق تقسیم دوتایی باکتری انجام می شود.

وجود اسپور در کشت باکتری ها برای تشخیص و تفکیک آنها اهمیت دارد ، زیرا تشکیل اسپور  اساسا محدود با باکتری های گرم مثبت میله ای شکل در دو جنس باسیلوس ها و کلستریدیوم ها است .

از جمله باکتری هایی که دارای اسپور هستند می توان جنس های کلستریدوم و باسیلوس، اسپوروسارسینا، اسپورولاکتوباسیلوس، دسولفوتوماکولوم، کوکسیلا بورتنی (ریکتزیای عامل تب کیو) را نام برد.

تصویر 1. تصویر میکروسکوپی Sporo lactobacillus

A. سلول های رویشی  B. اسپور

تصویر 2. تصویر میکروسکوپی Coxiella burnetii

تعدادی از باسیل های اسپورزا از عوامل مولد بیماری هستند . کلستریدیوم های بی هوازی از مشهورترین آنها هستند. کلستریدیوم بوتولینوم موجب مسمومیت غذایی (بوتولیسم) کشنده می شود. کلستریدیوم پرفرنجنز مولد قانقاریای گازی (شاربن علامتی) و کستریدیوم تتانی مولد کزاز(تتانوس) است . تمام این کلستریدیوم های اسپورزا اگزوتوکسین های (سم خارجی)قوی تولید می کنند که اغلب کشنده هستند. قویترین اگزوتوکسین توسط کلستریدیوم بوتولینوم تولید می شود. مصرف مقدار بسیار کم از ماده غدایی دارای سم بوتولیسم معمولا موجب مرگ می شود. یک شیشه کوچک نوشابه حاوی سم بوتولیسم برای کشتن تمام مردم کره زمین کافی است .

اسپور های کلستریدیوم پرفرنجنز و کلستریدیوم تتانی در خاک و بنابراین در مواد کثیف و غذا وجود دارند. در هر دو بیماری اسپور ها  توسط خاک و یا مواد خاک آلود داخل زخم می شوند. اگزوتوکسین قانقاریای گازی و کزاز در مقایسه با بوتولیسم کندتر عمل می کند بنابراین از طریق تلقیح آنتی توکسین می توان آنها را خنثی کرد. به دنبال خنثی سازی برای کشتن باکتری های مولد توکسین از آنتی بیوتیک استفاده می شود و بافتهای آسیب دیده را قطع می کنند تا شریاط بی هوازی از بین برود. در واقع معالجه بموقع موجب نجات از مسمومیت ناشی از این دو باکتری می شود.

بوسیله میکروسکوپ الکترونی در مقطع اسپور از داخل به خارج قسمت های زیر مشاهده می شود:

✅ هسته اسپور (Core):

از پروتوپلاست تشکیل شده که حاوی یک هسته کامل (کروموزوم) است. آنزیم های تنفسی سیتوکرومی در اسپور وجود ندارد. برخی از آنزیم های سلولی که در شکل رویشی باکتری وجود دارند در اسپور به مقدار زیاد مشاهده می گردد (مانند آلانین – راسماز) اما آنزیم دی پیکولینیک اسید سنتتاز تنها در اسپور وجود دارد. بخشی از توانایی مقاومت اسپور در مقابل حرارت مربوط به حالت نسبتا خشک و کم آب آن بوده و بخش دیگر مربوط به وجود مقادیر بسیار زیاد دی پیکولینات کلسیم است که در شکل رویشی باکتری وجود ندارد.

✅ غشاء داخلی(Inner membrane):

از غشاء سیتوپلاسمی باکتری منشاء می گیرد.

✅ دیواره اسپور(Spore Wall):

ماننند دیواره باکتری ها است که هنگام جوانه زدن منشاء دیواره سلولی باکتری خواهد بود.

✅ کورتکس(Cortex):

ضخیم ترین لایه اسپور است که جنس آن از نوعی پپتیدوگلیکان می باشد.

✅ غشاء خارجی (Outer membrane):

مانند غشاء داخلی است.

✅ پوشش اسپور(Spore Coat):

از ماده پروتئینی شبیه کراتین ساخته شده است که مقاومت آنتی بیوتیکی اسپور ها مربوط به این لایه اسپور می باشد.

✅ اگزواسپوریوم(Exosporium):

غشاء ظریفی از جنس لیپوپروتئین است که در برخی از گونه ها وجود دارد.

تصویر 3. اجزاء اسپور باکتری

به دوطریق می توان اسپور ها را زیر میکروسکوپ مشاهده نمود :

1- چون اسپور پوشش مقاومی است که در برابر نفوذ رنگ مقاومت می کند بنابراین در رنگ آمیزی معمولی می توان اسپورها را به صورت ناحیه رنگ نشده در داخل سلول رویشی (باکتری مولد) مشاهده نمود.

2- اگر تعداد اسپور های موجود کم باشد و یا اگر از داخل باکتری مولد خارج شده و در گستره به صورت پراکنده باشند اغلب توسط رنگ آمیزی ساده و یا گرم قابل مشاهده نخواهند بود.

اسپور را نمی توان به آسانی رنگ نمود و زمانی که رنگی را پذیرفت به آسانی نمی توان رنگ زدایی کرد. به این منظور برای نفوذ رنگ (سبزمالاشیت) به داخل پوشش اسپور از حرارت استفاده می شود. سبز مالاشیت به آسانی از جسم باکتری شسته می شود. چرا که دیواره سلولی بر اثر حرارت آسیب دیده و پاره شده است. بدین سان اسپور دارای رنگ سبز مالاشیت و باکتری بدون رنگ است که می توان با رنگ دوم (سافرانین) آن را رنگ آمیزی نمود. در مشاهده میکروسکوپی لام رنگ آمیزی شده، اسپورها درون باکتری های سرخ رنگ به صورت منطقه ای کروی یا بیضوی کوچک سبز رنگ دیده می شوند. اندازه، شکل  و محل اسپور در داخل باکتری برای تشخیص ارگانیسم ها اهمیت دارد.

الف) آزمایش (روش شافر Schaeffer  – فولتون  Fulton) :

طرز تهیه رنگ ها و محلول ها:

• مالاشیت گرین (محلول ۵/.%)

۵ گرم  مالاشیت گرین را در ۱۰۰سی سی آب مقطر حل کنید.

• سافرانین ( محلول ۵/. %)

۵/.گرم سافرانین را در ۱۰۰سی سی آب مقطر حل کنید.

روش آزمایش:

1- از باسیلوس سوبتیلیس گسترش تهیه نمایید و پس از خشک شدن با حرارت ثابت کنید.

2- گسترش را با سبز مالاشیت پوشانده و به مدت ۵ دقیقه روی حرارت حمام آب جوش قرار دهید.

3- مراقب باشید تا رنگ نجوشد و خشک نشود. برای جلوگیری از خشک شدن می توانید دوباره مقداری از سبز مالاشیت را روی لام اضافه نمایید.

4- رنگ را از روی لام خالی نمایید و به مدت 30ثانیه با آب آن را بشویید.

5- با سافرانین به مدت یک دقیقه گسترش را بپوشانید.

6- رنگ را خالی نموده و با آب لام را بشویید.

7- با کاغذ خشک کن لام را خشک نمایید

8- با روغن ایمرسیون و عدسی ۱۰۰ میکروسکوپ مشاهده کنید.

در این روش رنگ آمیزی ، اسپورها به رنگ سبز و باکتریها به رنگ قرمز مشاهده می شوند.

تصویر 4. مراحل رنگ آمیزی اسپور به روش Schaeffer _ Fulton  

ب ) روش آزمایش به روش دورنر(Dorner Method) :

1- پنج قطره آب مقطر سترون را درون لوله آزمایش بریزید و باکمک فیلدوپلاتین کلنی باسیلوس سوبتیلیس را به درون لوله انتقال داده و سوسپانسیون غلظی از آن تهیه نمایید.

2- پنج قطره از کربول فوشین را به سوسپانسیون داخل لوله اضافه نمایید.

3- لوله آزمایش را به مدت ۱۰ دقیقه درون آب جوش قرار دهید.

4- قطره کوچکی از محلول ۱۰% نیگروزین را روی لام قرار داده و چند لوپ از سوسپانسیون فوق را در آن حل نمایید.

5- با استفاده از انتهای یک لام، قطره مذکور را روی لام پخش کنید.

6- صبر کنید تا گسترش به دست آمده در حرارت آزمایشگاه خشک شود.

7- آب مقطر ۱۰۰ ميلي ليتر میکروسکوپ با عدسی ۱۰۰ مشاهده نمایید.

طرز تهیه رنگ كربول فوشين مورد استفاده در این روش:

• فوشين قليائي ۴ گرم

• الكل اتانول ۲۰ ميلي لیتر

• فنل ۸ ميلي گرم

• آب مقطر ۱۰۰ میلی لیتر

آب مقطر را به آرامی با فنل مخلوط نموده و سپس محلول رنگ فوشین در الکل را به آن اضافه کنید. حجم نهایی را به خوبی مخلوط نموده و برای یک شب در حرارت ۳۷ درجه سانتیگراد باقی بگذارید. سپس با استفاده از کاغذ صافی آن را صاف کنید.

در این روش زمینه لام سیاه رنگ، اسپور قرمز رنگ  و باکتری بی رنگ است.

تصویر 6. مراحل رنگ آمیزی اسپور به روش Dorner

تصویر 7. رنگ آمیزی اسپور به روش Dorner

ج) رنگ آميزي اسپور به روش مولر( Moeller) 

۱-گسترش را با حرارت ثابت كنيد.

۲-فوشين فنيكه غليظ را روي لام بريزيد و به ملايمت حرارت دهيد تا به مدت ۱۰ دقيقه بخار متصاعد شود ولي رنگ روي لام نجوشد و خشك نشود (توصيه مي شود براي حرارت دادن لام را برروي پايه فلزي قرار دهيد.)

۳- لام را با آب بشوئيد.

۴- بوسيله الكل مطلق عمل رنگ بري را انجام دهيد تا گسترش به رنگ گلي كم رنگ درآيد.

۵- لام را با آب بشوئيد.

۶- متيلين بلو را روي گسترش ريخته و ۳ دقيقه صبر كنيد.

۷- لام را با آب بشوئيد.

8- پس از خشك كردن لام با استفاده از روغن سدر و عدسي ۱۰۰ آنرا زير ميكروسكوپ مطالعه كنيد.

اسپورها به رنگ قرمز و باکتریها به رنگ آبي ديده مي شوند.

تصویر 8. رنگ آمیزی اسپور به روش Moeller